短鏈脂肪酸靶標(biāo)定量（代謝組學(xué)）檢測(cè)分析方案
一、項(xiàng)目簡(jiǎn)介
1.1 短鏈脂肪酸概述
短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），也稱揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acids，VFA），根據(jù)碳鏈中碳原子的多少，把碳原子數(shù)為1-6的有機(jī)脂肪酸稱為短鏈脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸。
短鏈脂肪酸被后腸迅速吸收后，既儲(chǔ)存了能量又降低了滲透壓，并且短鏈脂肪酸對(duì)于維持大腸的正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能具有重要作用。近端及遠(yuǎn)端結(jié)腸內(nèi)SCFAs濃度分別約120mol/L和90mol/L，其中重要且相對(duì)較多（占總量95%）的是乙、丙、丁酸，三者比例大致為3:1:1。受發(fā)酵底物、細(xì)菌種類等因素的影響，腸道內(nèi)所產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的種類和數(shù)量不同，其發(fā)揮的作用也不盡相同。
表1. 腸道內(nèi)主要細(xì)菌數(shù)量及代謝產(chǎn)物
1.2 技術(shù)路線
圖1. 短鏈脂肪酸靶標(biāo)定量（代謝組學(xué)）技術(shù)路線圖
1.3分析內(nèi)容
基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析包括：數(shù)據(jù)預(yù)處理，差異化合物篩選，PCA模式識(shí)別。
1.4檢測(cè)平臺(tái)
分析檢測(cè)平臺(tái)：GC-FID或GC-MS
二、檢測(cè)分析方案
2.1標(biāo)準(zhǔn)品配置
建立標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)清單見表2：
4.png
表2. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)列表
我們采用嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系來保證數(shù)據(jù)的可靠性：
5.png
表3. 質(zhì)量控制體系
說明：
⒈精密度：指用某種方法重復(fù)測(cè)定同一均質(zhì)樣品所得測(cè)定值的彼此接近程度，表示分析結(jié)果的重復(fù)性。常用標(biāo)準(zhǔn)差（SD）或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。在相同條件下，由一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性；在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度；在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。
⒉準(zhǔn)確度：指測(cè)定值（平均值）與真實(shí)值的接近程度，該指標(biāo)主要是通過回收率來反映。
3.回收率：在空白樣本中添加一定量待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，制成已知含量的樣本，然后按擬定的方法對(duì)樣本進(jìn)行提取、凈化和測(cè)定。所得到的實(shí)測(cè)值與已知值比較，實(shí)測(cè)值與已知值的百分率即為該方法的回收率。
6.png
2數(shù)據(jù)預(yù)處理
對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰解卷積，積分，峰對(duì)齊，標(biāo)準(zhǔn)化處理。通過原始總離子流(TIC)色譜圖，初步觀察儀器的保留時(shí)間重現(xiàn)性，所測(cè)得物質(zhì)的情況。
2.3 定量結(jié)果
通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中短鏈脂肪酸的定量結(jié)果，并結(jié)合學(xué)氏T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)組間差異表達(dá)的化合物。1514339817823940.png
表4. 短鏈脂肪酸定量分析結(jié)果
2.4 PCA分析
對(duì)樣本進(jìn)行主成分分析能從總體上反應(yīng)各組樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。使用SIMCA軟件(V14.1, Umetrics, Umea, Sweden)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行UV格式化（Unit Variance Scaling）和平均中心化（Mean-Centered）處理，然后進(jìn)行自動(dòng)建模分析，以獲得更加可靠且更加直觀的結(jié)果。
