【產(chǎn)品名稱】小鼠肝炎病毒探針法熒光定量 RT-PCR試劑盒
Name ：MouseHepatitisVirus(MHV)ProbegRT-PCRKit
【包裝規(guī)格】50次/盒
【預期用途】小鼠肝炎病毒(MouseHepatitisVirus ，MHV)是一種 RNA 病毒 ，病毒存在于血液和內臟 ，特別是 肝和腎 ，也見于糞尿中 ，對幼鼠有高度的傳染性 ，小鼠肝炎是由 MHV 所致的 1 種的傳染病 ，帶毒 小鼠分布于，但在正常情況下大多呈不顯性感染 ，只在應激因素激發(fā)下才能成為致死性疾病 ，主 要為肝炎和腦炎 ， 因此小鼠肝炎病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用 。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測小鼠肝炎病毒的試劑盒 ，它具有下列特點：
1.即開即用 ，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化 ，靈敏性高。
3.提供陽性對照 ，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高 ，引物是根據(jù)小鼠肝炎病毒高度保守區(qū)設計，不會跟其他病毒的RNA 發(fā)生交叉反應。
5.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。
6.本產(chǎn)品只能用于科研。
【規(guī)格及成分】
成分 | 包裝 |
探針法 qRT-PCR 緩沖液 | 500 μL |
探針法 qRT-PCR 酶混合液 | 100μL |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL |
小鼠肝炎病毒探針法 qRT-PCR 引 物-探針混合液 | 150 μL |
小 鼠 肝 炎 病 毒 探 針 法 qRT- PCR 陽性對照(1 × 10E7 拷貝/μL) | 50 μL |
使用手冊 | 1份 |
【運輸及保存】低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】樣品 RNA。
小鼠肝炎病毒探針法熒光定量 RT-PCR試劑盒【使用方法】一、稀釋標準曲線樣品 (以 10E2- 10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)由于標準品濃度非常高 ， 因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行 ，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分 。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原 ，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照 ，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照 。
1.標記 6 個離心管 ，分別為 6 ， 5 ， 4 ， 3 ， 2, 1。
2.用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液 (最好用帶芯槍頭 ， 下同) 。
3.在 6 號管中加入 5μL1 × 10E7 拷貝/μL 的陽性對照 (試劑盒提供) ，充分震蕩 1 分鐘 ，得 1 × 10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品 。放冰上待用。
4.換槍頭 ，在 5 號管中加入 5μL1 × 10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得) ，充分震蕩 1 分鐘， 得 1 × 10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品 。放冰上待用。
5.換槍頭 ，在 4 號管中加入 5μL1 × 10E5 拷貝/μL 的陽性對照 (上步稀釋所得) ，充分震蕩 1 分 鐘 ，得 1 × 10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品 。放冰上待用。
6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品 。放冰上用 。
二、樣品 RNA 的制備
7 .如果有 N 個樣品 ，最好設置 N+2 個提取 ， 多出的一個是 PC (樣品制備陽性對照) ，一個是 NC (樣品制備陰性對照) ?？梢杂? 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣 ， 以此作為 PC 。 另外用水作為 NC。
8 .用自選方法純化樣品的 RNA ， 本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三ProbeqRT-PCR反應 (20μL 體系，在樣品制備室進行)
9 .如果做定量分析并且只做 1 次重復 ，則標記 N+9 個 PCR 管 ，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品 ， 1 個用于 PCR 陰性對照 (用水做模板) ， 6 個用于標準曲線 。如果做定性分析 ， 并且 只做 1 次重復 ，則標記 N+4 個 PCR 管 ， 其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品 ， 1 個用于 PCR 陰性對照 (用水做模板) ， 1 個用于 PCR 陽性對照 (用第 4 號管中的陽性對照稀釋液做模板) 。 下面只以定量分析為描述操作步驟，
10 . 在標記管中按下表加入各成分 (本表只列出一次重復 。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽 性對照 ， 并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加)
成分/每管
| 樣品管 N+2 個 | PCR 陰性對照 | PCR陽性對照管 (2-6管) |
探針法 qRT-PCR 緩沖液 | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
探針法 qRT-PCR 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
小鼠肝炎病毒探針法 qRT-PCR 引物-探針混合液 | 3μL | 3μL | 3μL |
待測樣品 RNA 模板 | 5μL | - | - |
超純水 | - | 5μL | - |
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液( 2-6 號) | - | - | 各 5μL ( 2 號樣到 2 號 管，3 號樣到 3 號管 … ) |
11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 qRT-PCR：
過程 | 溫度 | 時間 |
逆轉錄 | 50℃ | 30min |
預變性 | 94℃ | 10min |
qRT-PCR 反應( 40 個循環(huán)) | 94℃ | 15 sec |
60℃ | 1min (采集 FAM 通道的熒光信號) |
四：數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測 ， 則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸 ， 以 Ct 值為縱軸 ， 繪制標 準曲線 。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值 ，再推算出其濃度。
13 . 如果把本試劑盒用于定性檢測 ，只判斷陽性或陰性 ，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40 。 陽 性對照必須有熒光對數(shù)增長 ，有典型擴增曲線 ，Ct 值應該小于或等于 30 。對待測樣品 ，如果 其 Ct 大于或等于 40 則為陰性 ， 如果小于或等于 35 則為陽性 。 如果在 35-40 之間 ，則重復一次 。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性 ，如果小于 35 ，則為陽性。
