廣東省藥物結(jié)構(gòu)確認(rèn)及雜質(zhì)分析-CMA資質(zhì)
蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對象是一個在時間和空間上動態(tài)變化的整體，具有的復(fù)雜性。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入和發(fā)展，尤其是差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)展，大量功能蛋白質(zhì)和潛在疾病蛋白質(zhì)標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)并被鑒定，如何進(jìn)一步探測這些蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度，以闡明其功能和在疾病研究中的意義，已變得越來越重要。僅僅依賴蛋白質(zhì)大規(guī)模分離、鑒定的技術(shù)路線(雙向凝膠電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)，質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)) 已經(jīng)不能滿足這些研究的需求，迫切需要更高靈敏度和更高選擇性的研究方法。而質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)技術(shù)作為一種高特異性、高靈敏度的質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲取方式，在進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)更具針對性的研究中發(fā)揮了重要作用[1]，逐步受到更多的研究者們關(guān)注。
1. MRM 技術(shù)的原理
M R M 技術(shù)是基于已知信息或假定信息設(shè)定質(zhì)譜檢測規(guī)則，對符合規(guī)則的離子進(jìn)行信號記錄，去
除大量不符合規(guī)則離子信號的干擾，從而得到質(zhì)譜信息的一種數(shù)據(jù)獲取方式。具體地說，即是根據(jù)多肽母離子質(zhì)量數(shù)和碎片離子質(zhì)量數(shù)，選擇母離子- 子離子對，允許符合設(shè)定的母離子進(jìn)入碰撞室，碰撞完成后，只記錄設(shè)定子離子信號。通過母離子和子離子的兩次選擇，去除干擾離子，降低化學(xué)背景，提高靈敏度[2]。在分析化學(xué)領(lǐng)域，這種質(zhì)譜掃描模式已成熟地用于復(fù)雜體系中小分子化合物的分析，如環(huán)境分析、毒物分析、藥物代謝物分析等[3,4]。而近年來MRM 技術(shù)與多種質(zhì)譜掃描模式的靈活結(jié)合，例如MIDAS(MRM-initiated detection and sequencing，是基于M R M 獲取的信號結(jié)果，對達(dá)到設(shè)定信號閾值的多肽再進(jìn)行高分辨產(chǎn)物離子掃描，從而對目標(biāo)肽段進(jìn)行高靈敏度鑒定的方法)，使復(fù)雜目標(biāo)物的定性結(jié)果更為可靠，拓寬了其在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。
2. MRM 技術(shù)的特點
靈敏度高：MRM 技術(shù)通過兩級離子選擇，排除了大量干擾離子，使質(zhì)譜的化學(xué)背景大大降低。目
標(biāo)檢測物的信噪比顯著提高，能夠完成其他質(zhì)譜掃描方式所*的高靈敏度檢測。重現(xiàn)性好：質(zhì)譜信號重現(xiàn)性差在一定程度上是因為復(fù)雜生物樣本基體和共流出組分對待測分子離子化、質(zhì)譜信號的抑制及源內(nèi)碰撞碎裂過程的影響導(dǎo)致。而在M R M 技術(shù)質(zhì)譜信號采集中，后兩者的影響被大大降低，因此重現(xiàn)性也相應(yīng)提高。準(zhǔn)確度高：利用M R M 技術(shù)特異性，對符合設(shè)定的多肽進(jìn)行檢測，并且進(jìn)一步進(jìn)行增強(qiáng)產(chǎn)物掃描分析，得到高分辨的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)碎片數(shù)據(jù)，使分析過程中的定性結(jié)果假陽性率大大降低。該技術(shù)與中性丟失相比，后者易檢測到一些產(chǎn)生相似質(zhì)量丟失的假陽性肽，而一些不易產(chǎn)生中性丟失的目標(biāo)肽也有可能沒被檢測。而M R M 技術(shù)則尋找產(chǎn)生特異碎片的特異母離子，鑒定準(zhǔn)確度高于全掃描和中性丟失質(zhì)譜掃描模式。通量高：使用目前進(jìn)的質(zhì)譜系統(tǒng)，MRM 技術(shù)每個工作循環(huán)能處理多達(dá)300 對母離子- 子離子，這種特點為研究多種蛋白質(zhì)的多種修飾和豐度變化提供了機(jī)會，更能滿足蛋白質(zhì)組學(xué)的研究需求。
3. MRM 技術(shù)在生物標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用運(yùn)用蛋白組學(xué)的方法進(jìn)行生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和檢測是目前蛋白質(zhì)組研究的熱點。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用二維凝膠電泳或鳥法(shotgun)技術(shù)尋找上調(diào)或下調(diào)蛋白質(zhì)以發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的研究策略已得到很大的豐富和完善。目前，標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)- 驗證- 臨床確證的研究模式已得到研究者們的廣泛認(rèn)可[5,6]。即在發(fā)現(xiàn)階段從疾病組織中尋找與正常組織有差異的蛋白質(zhì)，到驗證階段使用M R M 技術(shù)于組織周邊體液或血漿中檢測該差異蛋白質(zhì)，利用子離子譜進(jìn)行定性，后用M R M 技術(shù)和同位素稀釋或質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記(mTRAQ)的方法對篩選出來的標(biāo)記物定量，進(jìn)行臨床確證。這種研究模式使體液中生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和驗證更為有效、科學(xué)和合理。MRM 技術(shù)與金標(biāo)準(zhǔn)ELISA 相比，周期更短、成本更低，更重要的是能進(jìn)行與同一疾病相關(guān)的多個標(biāo)記物同時測定且不需制備其相應(yīng)的抗體，具有*的應(yīng)用*性。M R M 技術(shù)在驗證和確證階段都有極其重要的應(yīng)用，充分體現(xiàn)了該技術(shù)在生物標(biāo)志物檢測領(lǐng)域的價值。例如，在Whiteaker 等[7]的研究中，以小鼠為模型研究乳腺癌的生物標(biāo)志物；用液相色譜串連質(zhì)譜(LC-MS/MS)對腫瘤和正常乳房組織的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，篩查出700 個以上差異蛋白質(zhì)；再聯(lián)合抗體和MRM 技術(shù)后鑒定了fubulin-2 作為血漿中的生物標(biāo)志物。實驗結(jié)果進(jìn)一步驗證了M R M 技術(shù)驗證生物標(biāo)志物的方法，在發(fā)現(xiàn)新型生物標(biāo)志物研究中的可行性。Kuhn 等研究[8]表明，MRM 技術(shù)與同位素標(biāo)記相結(jié)合進(jìn)行定量分析，可以節(jié)省分析時間，并且能得到與抗體和免疫分析等經(jīng)典驗證方法具良好相關(guān)性的檢測結(jié)果。他們采用同位素標(biāo)記合成肽段和MRM 技術(shù)相結(jié)合，檢測來自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血漿樣本中診斷標(biāo)記物C- 反應(yīng)蛋白的濃度，并對方法的回收率、線性等進(jìn)行了考察，結(jié)果能達(dá)到高達(dá)66%的回收率和3 個數(shù)量級以上的線性范圍。
4. MRM 技術(shù)在蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究中的應(yīng)用蛋白質(zhì)翻譯后修飾在許多生命活動的調(diào)節(jié)過程中起到非常重要的作用。蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程的闡明，有利于人們更深刻地理解生命體的生理和病理過程。以蛋白質(zhì)磷酸化修飾為例，MRM 技術(shù)在翻譯后修飾的研究領(lǐng)域中顯示了其*的特點和優(yōu)勢。例如，磷酸化蛋白質(zhì)被酶切后，磷酸化多肽的信號淹沒在大量非磷酸化多肽的信號中，需要進(jìn)行磷酸化多肽的富集來提高分析靈敏度，改善分析效果，但即便如此仍難以獲得滿意的分析結(jié)果，靈敏度低遺漏大量信息。而以下幾個實例則充分展現(xiàn)了MRM技術(shù)在蛋白質(zhì)磷酸化分析中的優(yōu)勢。
Unwin 等[9]采用MIDAS 模式在對蛋白質(zhì)磷酸化修飾研究所得到的結(jié)果中，既使對于500 fmol 蛋白
質(zhì)混合物中僅有20 fmol磷酸化蛋白質(zhì)這樣信號被高度抑制的情況，也能夠得到磷酸化多肽的檢出，比用母離子檢測動態(tài)范圍提高了一個數(shù)量級。Wolf-Yalin等[10]在用IDA(information dependant
acquisition；選擇一級質(zhì)譜信號中豐度的三個離子進(jìn)行子離子掃描的一種質(zhì)譜信號采集方式)-MRM方法定量分析蛋白質(zhì)磷酸化介導(dǎo)的信號通路過程中，比較了I D A 信號采集模式和M R M 信號采集模式對酶切多肽混合物四次分析得到的肽段鑒定重復(fù)性實驗結(jié)果，前者的重復(fù)性僅為34%，而后者高達(dá)88%。重復(fù)性的提高體現(xiàn)了M R M 技術(shù)的優(yōu)勢，更有利于對磷酸化修飾的動態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測和構(gòu)建其相互作用網(wǎng)絡(luò)。Ahmed 等[11]同樣采用MRM 的方法，對細(xì)胞內(nèi)外生物標(biāo)志物的多種修飾進(jìn)行研究，定量了16 個生物標(biāo)志物，并對這些細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)修飾的功能作了初步闡釋。
5. MRM 技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用復(fù)雜組分共流出物的干擾和寬達(dá)9 個數(shù)量級以上的動態(tài)范圍，一直是影響血清或血漿等生物體液中蛋白質(zhì)、多肽準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵因素。盡管研究者們也嘗試采用多種方法，包括盡可能充分的色譜分離，去除高豐度蛋白質(zhì)等，但質(zhì)譜對低豐度蛋白質(zhì)
的檢測靈敏度和精密度仍不能滿足分析的要求。M R M 技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用上展現(xiàn)了其方法
的優(yōu)點。首先，在一定程度上提高了測定的動態(tài)范圍，其原因一方面是因為對離子的選擇檢出，降低了復(fù)雜組分的背景信號，增強(qiáng)了一些低豐度蛋白質(zhì)的檢測靈敏度；另一方面通過對高豐度、低豐度蛋白質(zhì)M R M 離子對的選擇來均衡兩者的響應(yīng)信號差異。例如，對高豐度蛋白質(zhì)，選擇響應(yīng)豐度較低的母離子- 子離子對；對低豐度蛋白質(zhì)，選擇響應(yīng)程度較高的母離子- 子離子對，從而均衡高、低豐度的信號差異。其次，減少了復(fù)雜組分共流出物的干擾，增強(qiáng)了檢測的特異性。此外，MRM 技術(shù)高通量的特點，也為多種蛋白質(zhì)的同時定量提供了條件。M R M 技術(shù)通過與同位素稀釋法或m T R A Q 技術(shù)結(jié)合，對已知量加入的內(nèi)標(biāo)肽段和樣本中的真實肽段分別進(jìn)行標(biāo)記，選擇不同母- 子離子對獲得不同的色譜檢出信號，比較兩者信號，從而產(chǎn)生定量結(jié)果[12,13]。
Anderson 等[14]用MRM 技術(shù)定量分析了人體血漿中53 種高、中豐度蛋白質(zhì)。其中47 個數(shù)據(jù)同批變異系數(shù)為2%～22%，顯示了定量的良好精密度。分析結(jié)果的動態(tài)范圍達(dá)到4.5 個數(shù)量級。Lin 等[15]用M R M 定量測定了人體血漿中中等豐度蛋白質(zhì)的實際濃度。測定結(jié)果表明其濃度范圍達(dá)到了3～700 nmol/L。12 次反復(fù)測量變異系數(shù)(CV)值小于25%。對于血漿中的低豐度蛋白質(zhì)，Keshishian 等[16]也采用MRM 和同位素稀釋的方法進(jìn)行了定量分析。在未進(jìn)行蛋白質(zhì)或多肽親和富集的條件下，去除血漿6 種高豐度蛋白質(zhì)后，低豐度蛋白質(zhì)的檢測限在1～10 mg/L，CV值在3%～15%，與質(zhì)譜直接檢測血漿蛋白的方法相比，分析性能改善了1000 倍。實驗結(jié)果顯示了這種MRM 技術(shù)進(jìn)行定量的高精密度，以及用于分析復(fù)雜樣本的高動態(tài)范圍。
6. MRM 技術(shù)在蛋白質(zhì)與RNA 相互作用研究中的應(yīng)用蛋白質(zhì)- R N A 復(fù)合物在調(diào)控真核細(xì)胞的基因表達(dá)上具有重要意義。基于M S 的方法研究蛋白質(zhì)與R N A 的相互作用多有報道，而采用M R M 與其他技術(shù)相結(jié)合的方法，能更深入地研究蛋白質(zhì)與RNA 作用的結(jié)構(gòu)域，得到更豐富的相互作用結(jié)構(gòu)信息。其原理是：通過母離子掃描的模式，獲得含有磷酸碎片的所有多肽離子的準(zhǔn)確分子量和電荷數(shù)。設(shè)計MRM 離子對，母離子掃描獲得的信號離子作為母離子，子離子設(shè)定為堿基序列AUGC ，在MRM 的檢測域值達(dá)到設(shè)定值后，進(jìn)行高分辨增強(qiáng)子離子掃描, 終獲取蛋白質(zhì)序列信息和與其作用的R N A 序列信息。Lenz 等[17]采用此方法，研究了U1SnRNP 和1515K-61K-U4atacSnRN 與RNA 的相互作用信息，分別用*和R N A 酶T 1、A 對蛋白質(zhì)和R N A 進(jìn)行酶切，得到相互作用的短肽段和RNA 的短序列，在負(fù)離子模式進(jìn)行母離子掃描，依據(jù)獲得的結(jié)果設(shè)計MRM 母- 子離子對，在正離子模式進(jìn)行MRM-子離子增強(qiáng)掃描，后得到了相互作用結(jié)構(gòu)域等更為詳細(xì)的信息。
7. 展望M R M 技術(shù)是基于蛋白質(zhì)或多肽的已知信息或假定信息進(jìn)行質(zhì)譜信號采集，有針對性地獲取數(shù)據(jù)的方式。通過與其他質(zhì)譜掃描技術(shù)的聯(lián)合使用，能在蛋白質(zhì)組研究中充分展現(xiàn)其高靈敏度、高準(zhǔn)確性、高重復(fù)性、高通量的應(yīng)用優(yōu)點?？梢灶A(yù)見，通過對M R M 技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化，例如優(yōu)化M R M 母－子離子的選擇條件，從已有的蛋白質(zhì)譜中人工獲取或利用軟件計算母- 子離子；優(yōu)化每次運(yùn)行MRM 離子對的數(shù)目，改善色譜峰形，或者通過設(shè)立不同時間段檢測離子對，增加分析通量；聯(lián)合其他多種質(zhì)譜掃描技術(shù)，將使M R M 技術(shù)擁有更好的應(yīng)用前景，更有效地滿足蛋白質(zhì)組學(xué)的分析需求。
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