Cell Meter™檢測試劑盒是一套用于監(jiān)測細胞活力和增殖的工具。有多種參數(shù)可用于監(jiān)測細胞活力和增殖。在正常細胞中，DNA密度根據(jù)細胞是生長，分裂，靜止還是執(zhí)行其正常功能而變化。細胞周期的進程受各種細胞周期調(diào)節(jié)因子之間復雜的相互作用控制。這些調(diào)節(jié)劑激活轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合并開啟或關閉導致細胞分裂的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。在這種調(diào)節(jié)級聯(lián)反應中的任何失誤都會導致細胞異常增殖，這是許多病理狀況（例如腫瘤形成）的基礎。活細胞研究的潛在應用是確定細胞DNA含量和細胞周期分布，以檢測生長模式的變化，監(jiān)測細胞凋亡以及評估腫瘤細胞的行為和抑制基因的機制。該特定試劑盒旨在使用Nuclear Red™CCS1（固定細胞中的細胞周期染色劑）監(jiān)測細胞周期進程和增殖。染料穿過透化的膜并插入細胞DNA中。試劑盒中提供的RNase降解RNA后，Nuclear Red™CCS1的信號強度與DNA含量成正比?？梢允褂昧魇郊毎麅x（FL2通道）監(jiān)測給定樣品中處于G0 / G1，S和G2 / M期的細胞百分比，以及處于凋亡之前的亞G1期的細胞百分比。
| 流式細胞儀 | |
| 激發(fā) | 488 nm激光 |
| 發(fā)射 | 610/20 nm濾光片 |
| 儀器規(guī)格 | PE-德州紅通道 |
| 組件A：100X Nuclear Red™CCS1 | 1小瓶（250 µL） |
| 組分B：100X RNase A | 1小瓶（250 µL） |
| 組分C：測定緩沖液 | 1瓶（50毫升） |
用5×10 5到1×10 6細胞/ mL 的密度制備含測試化合物的細胞
用70％乙醇固定細胞
將0.5 µL 100X Nuclear Red™CCS1和5 µL RNase A加入0.5 mL細胞溶液中
在室溫下孵育30-60分鐘
使用帶有FL2通道的流式細胞儀分析細胞
重要說明
開始實驗前，請在室溫下解凍所有組分。
程序
用測試化合物處理細胞所需的時間，以誘導凋亡或其他細胞周期功能。
對于每個樣品，以0.5×10 5至1×10 6細胞/ mL 的密度在0.5 mL PBS中制備細胞。
對于貼壁細胞：將細胞用yidanbaimei消化，懸浮在10％FBS培養(yǎng)基中，離心（1000 rpm，5分鐘），然后將沉淀重懸于PBS中。
對于懸浮細胞：將細胞離心（1000 rpm，5分鐘），并將沉淀物懸浮在PBS（1 mL）中。 注意：應單獨評估每種細胞系，以確定誘導凋亡的*細胞密度。
用70％乙醇固定細胞：
將0.5 mL細胞懸液吸移至1.2 mL無水乙醇中（ZUI終濃度約為70％）。
在冰上孵育細胞至少2小時（或在-20°C過夜）。在染色之前，細胞可以在-20°C下保存2年。注意：在細胞表面抗原被單克隆抗體染色后，通常將乙醇用于固定，而在細胞內(nèi)抗原被單克隆抗體染色后，通常將甲醇用于固定。在此過程中，將固定并分析整個單元格。由于仍然存在整個細胞團，因此通常包括使用RNase消除任何雙鏈RNA。盡管已經(jīng)對整個細胞進行了分析，但嘗試檢測與DNA結(jié)合的某些細胞內(nèi)抗原的嘗試可能會失敗，因為蛋白質(zhì)會從透化的細胞中漏出（例如綠色熒光蛋白）。在這些情況下，在酒精固定之前，用PBS中的1％多聚甲醛進行短暫的預固定（在4-6°C下10分鐘），將有助于將蛋白質(zhì)保留在細胞中。
用Nuclear Red™CCS1染色細胞：
以1000 rpm的速度沉淀細胞5分鐘，并用冷PBS至少洗滌一次。
將沉淀物懸浮在0.5 mL測定緩沖液（組分C）中。
加入5 µL 100X Nuclear Red™CCS1（組分A）和5 µL 100X RNase A（組分B）。
在室溫下孵育細胞30至60分鐘。注意：適當?shù)姆跤龝r間取決于所用的單個細胞類型和細胞濃度。優(yōu)化每個實驗的孵育時間。
可選：將細胞以1000 rpm離心5分鐘，然后將細胞重懸于0.5 mL檢測緩沖液（組分B）或您選擇的緩沖液中。
使用FL2通道（Ex / Em = 490/620 nm），通過流式細胞儀監(jiān)測熒光強度。在目標細胞上門，不包括碎片。
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