活性氧（ROS）是氧正常代謝的天然副產(chǎn)物，在細胞信號傳導(dǎo)中起重要作用。但是，在與氧化應(yīng)激相關(guān)的狀態(tài)下，ROS水平會急劇增加。ROS的積累會嚴重破壞細胞結(jié)構(gòu)。氧化應(yīng)激在心血管疾病，糖尿病，骨質(zhì)疏松癥，中風(fēng)，炎性疾病，許多神經(jīng)退行性疾病和癌癥中的作用已得到*。ROS測量將有助于確定氧化應(yīng)激如何調(diào)節(jié)各種細胞內(nèi)途徑。Cell Meter™熒光ROS檢測試劑盒使用我們*的ROS傳感器來定量活細胞中的ROS。ROS Green具有細胞滲透性。與ROS反應(yīng)時會生成綠色熒光。該套件是經(jīng)過優(yōu)化的“混合閱讀” 與HTS液體處理儀器兼容的測定形式。Cell Meter™熒光ROS測定試劑盒提供了一種靈敏的一步熒光測定法，可在培養(yǎng)一小時后檢測活細胞中的細胞內(nèi)ROS。該測定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行，無需分離步驟即可輕松實現(xiàn)自動化。使用熒光酶標儀或熒光顯微鏡可輕松讀取其信號。
平臺
| 熒光顯微鏡 | |
| 激發(fā) | FITC過濾器 |
| 發(fā)射 | FITC過濾器 |
| 推薦板 | 黑墻/透明底 |
| 熒光酶標儀 | |
| 激發(fā) | 490納米 |
| 發(fā)射 | 525納米 |
| 隔斷 | 515納米 |
| 推薦板 | 黑墻/透明底 |
| 儀器規(guī)格 | 底讀模式 |
組件
| 組分A：Amplite™ROS綠 | 1個小瓶 |
| 組分B：測定緩沖液 | 1瓶（20毫升） |
| 成分C：DMSO | 1小瓶（200 µL） |
協(xié)議范例
乍看上去
協(xié)議摘要
- 在生長培養(yǎng)基中準備細胞
- 添加Amplite™ROS Green工作溶液（對于96孔板為100 µL /孔，對于384孔板為25 µL /孔）
- 將細胞在37°C染色60分鐘
- 用測試化合物處理細胞以誘導(dǎo)ROS
- 在Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）或帶有FITC濾光片組的熒光顯微鏡下監(jiān)控?zé)晒庠黾樱ǖ撞孔x取模式）
重要說明
開始實驗之前，請在室溫下解凍所有試劑盒組件。
儲備溶液的制備
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，制備后應(yīng)儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1. Amplite™ROS Green儲備溶液（500X）：
將40 µL DMSO（組分C）添加到Amplite™ROS Green（組分A）小瓶中，并充分混合以制成500X Amplite™ROS Green儲備溶液。避光。注意：20 µL 500X Amplite™ROS Green儲備溶液足以用于1個板。為了存放，請將管子緊緊密封。
準備工作溶液
將20 µL 500X Amplite™ROS Green儲備溶液添加到10 mL的測定緩沖液（組分B）中，并充分混合以制成Amplite™ROS Green工作溶液。注意：此Amplite™ROS Green工作溶液在室溫下至少可穩(wěn)定2小時。
程序
- 將100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的Amplite™ROS Green工作溶液添加到細胞板中。
- 將細胞在5％CO 2和37°C的培養(yǎng)箱中孵育1小時。
- 在所需的緩沖液（例如PBS或HHBS）中，用20 µL 11X測試化合物（96孔板）或10 µL 6X測試化合物（384孔板）處理細胞。對于對照孔（未處理的細胞），添加相應(yīng)量的化合物緩沖液。
- 為了誘導(dǎo)ROS，在室溫下孵育或在5％CO單元板2，37℃的培養(yǎng)箱中至少15分鐘或在期望的時間段（30分鐘Hela細胞用1mM H處理2 ö 2）。
- 使用熒光酶標儀（Ext / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm））監(jiān)控?zé)晒鈴姸龋蚴褂脦в蠪ITC濾光片組的熒光顯微鏡觀察細胞。
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