產(chǎn)品名稱：石斑魚源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：
貨號(hào)：XG01P4317
分類：熒光定量PCR試劑盒
儲(chǔ)存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。
運(yùn)輸：低溫、避光，快遞免費(fèi)送貨上門。
實(shí)時(shí)定量PCR：
①β-actin陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽(yáng)性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應(yīng)體系如下：
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
序號(hào) 反應(yīng)物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 陽(yáng)性模板上游引物F 0.5μl
3 陽(yáng)性模板下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 陽(yáng)性模板DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
基因反應(yīng)體系：
序號(hào) 反應(yīng)物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 內(nèi)參照上游引物F 0.5μl
3 內(nèi)參照下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 待測(cè)樣品cDNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。
PCR特異性：
1.primers design
這是重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：
1)足夠長(zhǎng)，18～24bp，以保證特異性，當(dāng)然，不是說越長(zhǎng)越好，太長(zhǎng)的primer同樣會(huì)降低特異性，并且降低產(chǎn)量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性；
4)避免3'端GCrich，個(gè)BASE不要有GC，或者5個(gè)有3個(gè)不要是GC。
5)避免3'端的互補(bǔ)，否則，容易造成DIMER；
6)避免3'端的錯(cuò)配；
7)避免內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時(shí)不算，但在檢測(cè)互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)要加上它們；
9)使用兼并primer時(shí)，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；
10)學(xué)會(huì)使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。
吸水鏈霉菌應(yīng)城變種 Streptomyces hygroscopicus var. yingchengensis白靈側(cè)耳 Pleurotus nebrodensis
人睪支持細(xì)胞*培養(yǎng)基釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae
自養(yǎng)黃色桿菌 Xanthobacter autotrophicus松口蘑 Tricholoma matsutake
人腦成纖維細(xì)胞*培養(yǎng)基NCI-H661(人大細(xì)胞肺細(xì)胞)
MDA-MB-468(人腺細(xì)胞)無色透鏈霉菌 Streptomyces hyalinum
大鼠宮成纖維細(xì)胞*培養(yǎng)基Hs68(人男性正常龜細(xì)胞)
呂宋馬杜拉放線菌 Actinomadura luzonensisNCI-H520(人肺鱗細(xì)胞)
泡盛曲霉 Aspergillus awamori小鼠肺動(dòng)脈成纖維細(xì)胞*培養(yǎng)基
刺孢吸水鏈霉菌 Streptomyces hygrospinosus佛羅里達(dá)側(cè)耳 Pleurotus florida
人宮平滑肌細(xì)胞*培養(yǎng)基100mL
地衣芽胞桿菌 Bacillus licheniformis
人腦靜脈血管平滑肌細(xì)胞*培養(yǎng)基100mL
TE-13(人食管細(xì)胞)5×106cells/瓶×2
石斑魚源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒N-乙酰-D-丙氨
N-乙酰-D-丙氨
N-乙酰-D-丙氨
2(2-)
2(2-)
2(2-)
3-羥基苯甲甲酯
3-羥基苯甲甲酯
2-異乙酯
2-異乙酯
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測(cè)定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。
