Amplite 比色法草酰乙酸檢測(cè)試劑盒是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測(cè)草酰乙酸的試劑盒,草酰乙酸是檸檬酸循環(huán)的重要組成部分,它與乙酰*酶A反應(yīng)生成檸檬酸鹽。它還涉及糖異生,尿素循環(huán),乙醛酸循環(huán),氨基酸合成和脂肪酸合成。草酰乙酸的缺乏限制了糖原異生和尿素循環(huán)功能,并且可以導(dǎo)致能量產(chǎn)生減少。草酰乙酸也可用作血液谷*酸劑,在創(chuàng)傷性腦損傷后提供神經(jīng)保護(hù),表現(xiàn)為海馬神經(jīng)元損失減少和神經(jīng)功能。Amplite 比色草酰乙酸檢測(cè)試劑盒提供了一種靈敏的檢測(cè)方法,用于定量生物樣品中的草酰乙酸。草酰乙酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸,通過(guò)酶偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧化氫。用吸光度酶標(biāo)儀在575nm處用Amplite Red監(jiān)測(cè)過(guò)氧化氫的產(chǎn)生。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商,為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite 比色法草酰乙酸檢測(cè)試劑盒。
96孔板測(cè)定示例
概述
準(zhǔn)備測(cè)試樣品(50μL)和連續(xù)稀釋的草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品(50μL)
加入等體積的測(cè)定混合物(50μL)
在室溫下孵育30分鐘至1小時(shí)
監(jiān)測(cè)575nm處的吸光度強(qiáng)度
注意:在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前,在室溫下解凍所有試劑盒組分。
操作方法
1.準(zhǔn)備連續(xù)稀釋的草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品:
1.1將100μLDdH2O加入到草酰乙酸鹽標(biāo)準(zhǔn)小瓶(組分E)中以制備100mM草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.2制備草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)稀釋液:將10μL100mM草酰乙酸鹽(來(lái)自步驟1.1)加入990μL測(cè)定緩沖液(組分C)中,得到1mM草酰乙酸溶液。 將320μL的1mM草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入680μL測(cè)定緩沖液中以制備320μM草酰乙酸溶液。 進(jìn)行1:2連續(xù)稀釋,得到160,80,40,20,10,5μM連續(xù)稀釋的草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品。
1.3根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的表1,將50μL含草酰乙酸的樣品和連續(xù)稀釋的草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品加入透明底96孔微量培養(yǎng)板中。
2.準(zhǔn)備草酰乙酸測(cè)定混合物:
2.1Make Amplite 紅色底物原液(200X):將50μLDMSO(組分F)加入Amplite Red底物(組分A)中,制成200X Amplite Red底物原液。
2.2制備草酰乙酸脫羧酶(OAC)儲(chǔ)備溶液(100X):將50μLddH2O加入草酰乙酸脫羧酶(組分D)中以制備100×草酰乙酸脫羧酶原液。
2.3制備測(cè)定混合物:將5mL測(cè)定緩沖液(組分C)加入一個(gè)酶混合瓶(組分B)中充分混合。 將50μLOAC儲(chǔ)備溶液(來(lái)自步驟2.2)和25μL200XAmplite Red儲(chǔ)備溶液(來(lái)自步驟2.1)轉(zhuǎn)移到瓶中并充分混合。
注意1:分析混合物不穩(wěn)定,及時(shí)使用,避免直接暴露在光線下。
注意2:將未使用的200X Amplite Red原液儲(chǔ)存在-20℃,避免光照和反復(fù)凍融循環(huán)。
3.運(yùn)行草酰乙酸測(cè)定:
3.1將50μL測(cè)定混合物(來(lái)自步驟2.3)添加到草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品,空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中(參見(jiàn)步驟1.3),以使總草酰乙酸測(cè)定體積為100μL/孔。
注意1:對(duì)于384孔板,每孔加入25μL樣品,25μLAssay混合液。
注意2:在pH 6.5至7.0下進(jìn)行草酰乙酸測(cè)定。
3.2在室溫下孵育反應(yīng)混合物30分鐘至1小時(shí)。
3.3使用575 nm的吸光度讀板儀檢測(cè)吸光度的增加。