站在共聚焦成像與雙光子顯微術(shù)的上

尼康的A1R MP 是一款擁有獨到技術(shù)的雙光子顯微成像系統(tǒng)，不僅具備高分辨率檢流計式掃描器（galvanometer scanner），而且還配備了高速共振式掃描器（resonant scanner）。掃描速率在512 X 512像素水平下高達到30幀/秒；在帶狀掃描模式下可達420幀/秒。新型四通道NDD探測器（non-descanned detectors）具有更高的探測效率、更低的暗電流以及更寬的響應(yīng)光譜，可以對譜線相近的熒光探針進行實時光譜拆分與識別，并大大提高熒光圖像的對比度。此功能對于雙光子顯微鏡非常重要，因為在雙光子成像時一般只能使用單一的激發(fā)波長，往往不可避免地造成自發(fā)熒光以及發(fā)射光譜的重疊。


高達420幀/秒成像速率的共振掃描鏡    
尼康所*的共振掃描技術(shù)，較之于非共振的普通掃描器，大幅提高了寬視場掃描速率，達到了點掃描成像的快速率420幀/秒（512X32）。同時在512X512分辨率下亦可以實現(xiàn)30pfs的成像速度（FOV:18mm）。利用多光子顯微術(shù)專用的NDD探測器，可以對非常厚的標本進行深部快速成像。尼康的光學同步（optical pixel clock）技術(shù)充分保證了超高速圖像的均勻性和穩(wěn)定性。

A1R MP+超高速共振掃描頭發(fā)出的飛秒脈沖紅外激光激發(fā)生物體血管內(nèi)的血細胞，使用3個獨立的顏色通道，以30fps速度拍攝的三張連續(xù)熒光圖像中捕捉到血細胞運動。
箭頭表示示蹤的白細胞細胞核的移動情況。
三個熒光探針同時被激發(fā)，為細胞核 （藍色）、血管內(nèi)皮細胞（綠色）和血漿（紅色）成像。
長波超快激光與超高速共振掃描頭結(jié)合使用，能有效減小圖像失真，可實現(xiàn)生物分子的時間分辨多光子成像。

圖像分辨率512*512像素，圖像采集速度：每秒30幀，物鏡：水浸物鏡60×
合作拍攝者 Satoshi Nishimura 博士，PRESTO，東京大學，TSBMI，心血管醫(yī)學系，日本科學技術(shù)振興機構(gòu)提供。Japan Science and Technology Agency提供。







 高靈敏度NDD深部成像      
尼康新開發(fā)的多光子四通道NDD探測器能夠有效地進行標本深部的顯微成像。較普通探測器而言，NDD的感光元件面積更大，靈敏度更高，并安裝于距離物鏡后出光口（back aperture）最近的地方. 該配置有效地提高了對散射熒光的探測效率，具有更高的信噪比（S/N），對諸如活體組織等較厚的標本的拍攝，具有比普通共聚焦顯微鏡更為清晰穩(wěn)定的圖像質(zhì)量。
  

四通道反射NDD                                                                                                              四通道透射NDD

活體小鼠大腦皮層深層成像
用開顱法研究H-line5周齡小鼠的大腦皮層。可從底層到表層看到第五層表達EYFP的椎體神經(jīng)元的完整樹突。此外還研究了更深區(qū)域白質(zhì)中的熒光信號。
左：三維重建圖像   
右：z軸疊加圖像
         上圖：距離表層25μm深度部位的第五層椎體細胞的表層樹突
         中圖：第五層椎體細胞的基底樹突距離表層625μm
         下圖：白質(zhì)中的熒光
激發(fā)波長：930nm     物鏡：CFI75復消色物鏡25×W MP（NA1.10WD2.0）

合作拍攝者：Tomomi Nemoto博士，北海道大學電子科學研究所；Shigenori Nonaka博士，國家基礎(chǔ)生物學研究所；Takeshi Lmamura博士，愛媛大學醫(yī)學研究生院。


小鼠大腦皮層多色成像
使用950nm紅外激光對麻醉YFP-H小鼠進行成像，在3個通道中同時分別獲取兩個熒光信號和二次諧波產(chǎn)生（SHG）信號。
青色：硬腦膜的SHG信號
黃色：EYFP標記的皮層第五層椎體神經(jīng)元
紅色：SRB標記的血管
合作拍攝者：Ryosuke Kawakami博士，Terumasa博士，Tomomi Nemoto博士，北海道大學電子科學研究所。