高分辨率納米單顆粒分析儀 Nanocoulter Ⅰ
一種全“芯”的細(xì)胞外囊泡檢測(cè)手段
胞外囊泡主要由微囊泡（Microvesicles, MVs）和外泌體（Exosomes, Exs）組成，微囊泡是細(xì)胞激活、損傷或凋亡后從細(xì)胞膜脫落的小囊泡，直徑約為100nm – 1000nm。外泌體（exosome）是一種由細(xì)胞釋放到細(xì)胞外基質(zhì)的膜性小囊泡，直徑約為40-100nm（有說(shuō)30-150nm，目前尚無(wú)定論），廣泛存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液（血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁）中，攜帶有細(xì)胞來(lái)源相關(guān)的多種蛋白質(zhì)、脂類、DNA、mRNA、miRNA等，參與細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎癥疾病以及癌癥中都發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡水平的升高，它們很有可能成為這類疾病的診斷標(biāo)志物。
相比外泌體研究遍地開(kāi)花的火熱程度（僅國(guó)內(nèi)6月份就有217篇相關(guān)論文），外泌體純化和提取方法可謂是差強(qiáng)人意。目前主流的方法有超速離心（UC）、密度梯度離心（DGC）、免疫捕獲、聚合物沉淀（Precip）、超濾（UF）、排阻色譜（SEC），以及微流控分析芯片等。往往一種提取方法無(wú)法得到足夠純度、濃度的外泌體，每種方法的適用樣品種類也不一樣。
圖1 細(xì)胞外囊泡的形成過(guò)程
國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)（ISEV）在2014年提議，對(duì)于分離獲得的外泌體需要從三個(gè)層面進(jìn)行鑒定：
（1）Western Blot（WB）鑒定外泌體表面標(biāo)志物；
（2）透射電鏡（TEM）鑒定外泌體形態(tài)；
（3）粒徑分析鑒定外泌體大小。免疫印跡與電鏡觀察耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴，在實(shí)際研究中難以做到每個(gè)外泌體樣本都去做WB與TEM，所以急需一種快速簡(jiǎn)便的粒徑分析方法，來(lái)作為外泌體鑒定的 “先鋒” 。
Nanocoulter Ⅰ “芯”方式助力外泌體提取純化研究
圖2 Nanocoulter Ⅰ外觀
Nanocoulter Ⅰ 單顆粒檢測(cè)，可液體活檢、一個(gè)樣本測(cè)試僅需5-10分鐘，測(cè)試樣本可回收等特性，恰好貼合該需求，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞外囊泡（外泌體）的提取鑒定工作中。
圖3 Nanocoulter Ⅰ原理圖
圖4 Nanocoulter Ⅰ核心技術(shù)
納米庫(kù)爾特原理，測(cè)試過(guò)程是將待測(cè)外泌體分散在電解液中，隨其通過(guò)特定孔徑的納米孔芯片，外泌體通過(guò)納米孔的一瞬間會(huì)占用相同體積電解液的位置，在孔內(nèi)外兩電極間的電阻（恒電流設(shè)計(jì)的電路）會(huì)發(fā)生瞬時(shí)變化，產(chǎn)生電位脈沖。脈沖信號(hào)的強(qiáng)度和次數(shù)與通過(guò)納米孔的外泌體顆粒大小及數(shù)目成一定比例，直接將脈沖信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，即可獲得檢測(cè)樣品中外泌體的粒徑和粒子數(shù)信息。
Nanocoulter Ⅰ采用新一代電學(xué)原理，
?單顆粒檢測(cè)，顆粒粒徑、濃度、zeta電位、形態(tài)多維度檢測(cè)
?不受樣本吸光度、折射率影響，與樣本光學(xué)性質(zhì)無(wú)關(guān)
?與顆粒布朗運(yùn)動(dòng)無(wú)關(guān)，不受樣品黏度影響
?顆粒之間無(wú)干擾，對(duì)多分散樣本有很好的測(cè)試效果
?高分辨率，可精確看到樣本團(tuán)聚、破裂、沉降等細(xì)微變化
選型表
Nanocoulter Ⅰ 性能參數(shù)：
隨著研究的深入，更多的分離提取外泌體的方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)，也有多種提取方法聯(lián)用的方式，看似百花齊放，實(shí)則良莠不齊，甚至都不盡如人意。Nanocoulter Ⅰ 逐個(gè)測(cè)量外泌體粒徑，得到外泌體的真實(shí)粒徑濃度分布，可快速判斷提取方法的優(yōu)劣。
圖5 不同分離提取方法的外泌體粒徑測(cè)定
Nanocoulter Ⅰ的原理決定測(cè)得的數(shù)據(jù)為真實(shí)粒徑信息，無(wú)需經(jīng)過(guò)反演算或者推導(dǎo)得出，并且配備多種尺寸的已知粒徑和濃度的標(biāo)準(zhǔn)顆粒（60-300nm，20nm一個(gè)梯度）來(lái)作為基線數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)測(cè)量數(shù)據(jù)的定量校準(zhǔn)，確保粒徑、濃度數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。無(wú)論是不同粒徑的混合樣本，還是有細(xì)微差異的同粒徑樣本，均能準(zhǔn)確無(wú)誤的辨別出來(lái)。
圖6 不同廠家生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)微球的細(xì)微差異
圖7 外泌體樣本檢測(cè)信號(hào)脈沖圖
圖8 外泌體樣本測(cè)試報(bào)告
應(yīng)用領(lǐng)域：
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脂質(zhì)體、病毒與類病毒顆粒生產(chǎn)品質(zhì)把控及標(biāo)準(zhǔn)制定（mRNA疫苗 細(xì)胞治療、基因治療）；
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細(xì)胞外囊泡、外泌體不同提取方法的篩選，外泌體的鑒定；
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藥物載體、蛋白質(zhì)、疫苗、人造乳糜顆粒的粒徑、濃度測(cè)定，生產(chǎn)批間差控制；
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血細(xì)胞、血小板、細(xì)菌（油田等）、免疫檢測(cè)功能顆粒等微粒的計(jì)數(shù)；
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聚苯乙烯微球、磁珠顆粒等有機(jī)和無(wú)機(jī)顆粒品質(zhì)把控；
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化妝品、半導(dǎo)體、工業(yè)涂料、染料與墨水化學(xué)、機(jī)械拋光、催化劑等工業(yè)生產(chǎn)材料性能研究。
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