酵母 CFDA-AM/碘化丙啶活力試劑盒是測(cè)試酵母活力的簡(jiǎn)便方法。酵母 CFDA-AM/碘化丙啶活力試劑盒使用 CFDA-AM 和碘化丙啶。 CFDA-AM 是一種細(xì)胞可滲透的酯酶底物。底物的乙酰氧基甲基 (AM) 基團(tuán)將允許 CFDA 穿透細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞，親脂性封閉基團(tuán)和二乙酸基團(tuán)就會(huì)被酯酶裂解，產(chǎn)生綠色熒光。相比之下，碘化丙啶僅對(duì)細(xì)胞膜受損的酵母進(jìn)行染色，從而產(chǎn)生紅色熒光。
樣品分析方案
概述
準(zhǔn)備酵母樣品
添加 1 µL CFDA-AM 染料工作溶液
添加 2 µL 碘化丙啶染料
輕輕渦旋，在 37°C 下孵育 15-30 分鐘
使用 530/30 nm 和 576/26 nm 濾光片通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析
注：在打開小瓶之前，讓組分升溫至室溫。碘化丙啶易與核酸結(jié)合，應(yīng)將其視為潛在的誘變劑并小心處理。處理 DMSO 原液時(shí)應(yīng)特別小心，因?yàn)橐阎?DMSO 有助于有機(jī)分子進(jìn)入組織。
溶液配制
CFDA-AM染料工作液
1.將 100 μL 的 DMSO 添加到 CFDA-AM（組分 A）的小瓶中，渦旋混合。
注意 在 -20°C 中以一次性等分試樣儲(chǔ)存原液。避免反復(fù)凍融。
操作步驟
以下方案僅用作為參考使用，具體請(qǐng)根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整
1.以~ 106個(gè)細(xì)胞/ mL的濃度制備含1mL懸浮液的酵母樣品。
2.在每管實(shí)驗(yàn)樣品中加入 1 μL CFDA-AM 染料工作溶液和 2 μL 碘化丙啶（組分 B）。對(duì)于未染色的對(duì)照，將 1 組試管放在一邊，不添加染料。對(duì)于單色 CFDA-AM 對(duì)照，將 1 μL CFDA-AM 添加到一管未經(jīng)處理的細(xì)胞和一管死亡細(xì)胞中。對(duì)于單色碘化丙啶對(duì)照，將 1 μL 碘化丙啶添加到一管未經(jīng)處理的細(xì)胞和一管死細(xì)胞中。請(qǐng)注意，根據(jù)您的具體應(yīng)用，可能需要調(diào)整兩種染料的比例以獲得響應(yīng)。
3.輕輕渦旋每個(gè)管。然后將所有樣品在室溫下孵育 15 至 30 分鐘，避光。
4.使用配備 488 nm 激光、530/30 nm 過濾器和 575/26 nm 過濾器（FITC 和 PE 通道）的流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光。
注意 要使用熒光顯微鏡分析樣品，請(qǐng)?jiān)谳d玻片和蓋玻片之間捕獲 5 µL 染色酵母懸浮液。使用 FITC 和 Cy3 濾光片組在顯微鏡下觀察。
