英國(guó)Oxford 新一代超分辨熒光顯微鏡Nanoimager

英國(guó)Oxford Nanoimaging公司生產(chǎn)的產(chǎn)品超分辨熒光顯微鏡-Nanoimager 是由牛津大學(xué)Achillefs Kapanidis教授團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)8年時(shí)間研發(fā)而成的，是一種新型的單分子顯微鏡，也是世界上一款無(wú)需校準(zhǔn)、無(wú)需光學(xué)平臺(tái)、超小型臺(tái)式超分辨顯微鏡。Nanoimager突破了傳統(tǒng)光學(xué)的衍射極限，分辨率可達(dá)20nm，是一臺(tái)大視野單分子FRET顯微鏡。Nanoimager簡(jiǎn)單易用、設(shè)計(jì)緊湊，使用安全無(wú)害的一級(jí)激光，用戶在普通的實(shí)驗(yàn)室桌面上即可獲得高分辨率的單分子熒光圖像 。適用于單分子示蹤、活細(xì)胞成像、蛋白互作、3D成像等研究。

Nanoimager技術(shù)特征

超分辨率成像

♦ 支持同時(shí)雙色成像和順序四色成像

♦ 高能量帶來(lái)高精度

♦ 三維成像

♦ 隨機(jī)光學(xué)重建顯微技術(shù) (dSTORM)和光激活定位顯微技術(shù) (PALM)

√ 無(wú)需光學(xué)平臺(tái)

√ 使用前無(wú)需校準(zhǔn)

√ 操作簡(jiǎn)單方便

√ 便攜式，體積小

√ 普通實(shí)驗(yàn)桌即可安置

√ 采用1級(jí)激光，使用安全

Nanoimager顯微鏡設(shè)計(jì)

♦ Nanoimager具有和傳統(tǒng)顯微鏡不同的特殊設(shè)計(jì)。傳統(tǒng)顯微鏡需要集成單分子檢測(cè)功能的配件，同時(shí)也會(huì)帶來(lái)配件的限制性，而Nanoimager是專(zhuān)門(mén)為單分子超分辨成像而設(shè)計(jì)，為了達(dá)到更高的效率而移除了多余的成像元件；
♦ 配置更加安全的一級(jí)激光,Nanoimager可在任何辦公室、實(shí)驗(yàn)室和教室使用。相對(duì)于放置于暗室的大型顯微鏡,Nanoimager更加方便用戶的使用；
♦ Nanoimager的顯微鏡單位面積小于A4紙；配套的激光器通過(guò)光纖連接至顯微鏡；

♦ 與定制的顯微鏡和傳統(tǒng)的顯微鏡設(shè)計(jì)不同， Nanoimager始終保持校準(zhǔn)狀態(tài)。樣品準(zhǔn)備好后可以直接成像，無(wú)需花費(fèi)時(shí)間進(jìn)行調(diào)試和校正。
♦ Nanoimager的封閉式系統(tǒng)能夠防止偏移發(fā)生并阻止灰塵和其他污染物進(jìn)入，可以一直保持在正常工作狀態(tài)。作為一款臺(tái)式機(jī)， Nanoimager不需要傳統(tǒng)顯微鏡昂貴的配套設(shè)施，無(wú)需額外配置溫控房間、光學(xué)平臺(tái)、激光室或暗室。

Nanoimager技術(shù)原理

Nanoimager采用PALM/dSTORM技術(shù)，利用單分子定位算法并結(jié)合光學(xué)系統(tǒng)艾里斑的形狀，以超高精度（納米量級(jí)）獲得熒光分子的中心位置，然后用CCD將其信號(hào)進(jìn)行采集轉(zhuǎn)化最終得到分辨率為20nm的超分辨圖像。

成像模式

相對(duì)于普通的Epifluorescence(EPI)/模式，Nanoimager有total internal reflection fluorescence (TIRF)/ highly inclined and laminated optical sheet (HILO)兩種模式可自由切換。

EPI：激發(fā)較厚的樣品（＞10um），信號(hào)噪聲強(qiáng)，即傳統(tǒng)模式。

TRIF：激發(fā)薄層樣品（＜200nm），信號(hào)噪聲弱，適用于膜表面成像。

HILO：激發(fā)樣品厚度（＜10um），信號(hào)噪聲較弱，適用于大部分成像。

應(yīng)用領(lǐng)域

應(yīng)用案例

1、單分子FRET

Nanoimager是一臺(tái)用于大視野單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)的商業(yè)化儀器。 FRET是一種兩個(gè)熒光分子間非輻射性的能量轉(zhuǎn)移方式，反映兩者的分子間距。 FRET一般在2 – 10 nm的間距發(fā)生。 smFRET研究中，作為供體的熒光分子由激光激發(fā)，將能量轉(zhuǎn)移至臨近的受體熒光分子。被激發(fā)的受體將能量以熒光形式發(fā)散。供體與受體可以連接至同一個(gè)或者不同的分子。

smFRET可以用于測(cè)量核酸或者單個(gè)蛋白分子的分子內(nèi)距離，也可以用于研究蛋白亞基間的相互作用；還可應(yīng)用于研究藥物對(duì)于酶結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)的作用，或是神經(jīng)退行性疾病中蛋白的聚集。 smFRET可以用于在單分子層面推到結(jié)合常數(shù)、反應(yīng)途徑與停滯時(shí)間而不受總體平均值干擾。

Nanoimager適用于smFRET的關(guān)鍵功能包括：同時(shí)雙色成像；單分子散射光強(qiáng)度和總體平均的實(shí)時(shí)分析；視野中數(shù)千個(gè)單分子的高通量成像，以及用交替熒光激發(fā) (ALEX) smFRET的功能來(lái)定量化學(xué)計(jì)量與FRET效率。圖4是smFRET用于研究單個(gè)DNA霍利迪交叉的動(dòng)力學(xué)。

2、單分子示蹤

Nanoimager可以在兩個(gè)通道同時(shí)示蹤細(xì)胞或者純化物樣品中的單分子 (圖5)，并計(jì)算擴(kuò)散系數(shù)。細(xì)胞中分子的擴(kuò)散系數(shù)可以被示蹤，如酶或蛋白可以通過(guò)藥物和抗生素的反應(yīng)來(lái)示蹤。低擴(kuò)散率可以表示標(biāo)記分子與另一分子或結(jié)構(gòu)的相互作用或相結(jié)合。同時(shí)示蹤兩種標(biāo)記了不同熒光分子的分子可以確定兩者動(dòng)態(tài)相互作用的水平。

Nanoimager可以直接反映純化樣品中熒光粒子的擴(kuò)散率和預(yù)估大小，具有敏感性 (單熒光分子級(jí)別) 和特異性 (雙色標(biāo)記可以顯著降低檢測(cè)雜質(zhì)的可能性)。

3、使用Nanoimager成像—更大的視野

Nanoimager的每個(gè)成像通道均有50 µm x 80 µm的大視野，而其他大部分單分子顯微設(shè)備只有20µm x 20 µm的視野。視野中照明均勻，可以實(shí)現(xiàn)單分子或細(xì)胞的高通量成像并快速收集數(shù)據(jù)。
下圖顯示了以10倍于其他技術(shù)的速度對(duì)突變的大腸桿菌細(xì)胞的不同表型進(jìn)行成像。為了獲得不同表型的可靠的結(jié)果，需要對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行比較。使用具有大視野，能夠自動(dòng)對(duì)焦和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的Nanoimager可以顯著加快整個(gè)實(shí)驗(yàn)速度和通量。將大視野與超分辨成像結(jié)合是Nanoimager的優(yōu)勢(shì)。