diSPIM是一種靈活和易于使用的實施選擇性平面照明顯微鏡（的SPIM），允許雙視圖（d樣品的），而安裝在一個倒置顯微鏡上（即SPIM的物鏡是直立）。diSPIM由NIH / NIBIB和應用科學儀器（ASI）的Hari Shroff實驗室共同開發(fā)。SPIM也稱為光片熒光顯微鏡或LSFM，因為它使用光片或光平面垂直于成像方向照亮樣品。
什么是SPIM或LSFM？
選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）是一種快速而柔和的成像技術，將寬視野成像的速度與適度的光學切片和低的光漂白結合在一起。它已成為重要的熒光成像方式，尤其是對于體積成像。SPIM也稱為光片熒光顯微鏡（LSFM）或簡稱為“光片”。 SPIM或LSFM的定義特征是從側面對焦平面進行平面照明。在任何給定時間僅照亮樣品的一小部分，從而使光損傷最小化，并且提供光學切片，與寬視野落射熒光相比，可以提高SNR。由于以廣角（二維平行）方式收集圖像，因此，光片成像比點掃描共聚焦顯微鏡要快得多，點掃描共聚焦顯微鏡一次只能檢測一個像素。
光學薄片顯微鏡由于以下三個關鍵特性而迅速在體積成像中獲得普及：首先，由于將激發(fā)限制在焦平面附近，因此光損傷最小化，例如，生物存活的時間更長。第二，獲得良好的光學切片，通常接近共聚焦顯微鏡。第三，采集速度非?？?，比傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡快幾個數(shù)量級。 SPIM的主要缺點是，需要額外的光學器件來生成光片。見的是，將一個單獨的照明物鏡與檢測物鏡正交放置，并將產生紙張的光學器件放置在該照明物鏡和激光源之間。添加額外的鏡頭會給成像系統(tǒng)和樣品安裝帶來空間限制。從本質上講，顯微鏡需要圍繞樣品進行設計，因此存在各種各樣的光片顯微鏡設計，每種設計都不同的樣品和不同的安裝要求。相比之下，傳統(tǒng)的共聚焦或落射熒光顯微鏡只有一條光路，可以容納更多種類的樣品。換句話說，SPIM的優(yōu)點是以任何單個工具的適用范圍更窄為代價的。
方案
將兩個物鏡以直角放置在水平安裝在開放式培養(yǎng)皿中的樣品上方，每個物鏡與垂直方向成45度角。從一個物鏡創(chuàng)建一個光片，并使用另一個物鏡對其進行成像。通過將光片移動通過樣品來收集一堆圖像。對于某些應用程序，單個視圖或堆棧中的3D信息就足夠了（iSPIM）。對于雙視圖系統(tǒng)，兩個物鏡的作用相反，以從垂直方向收集另一個堆棧，然后可以將兩個數(shù)據(jù)集進行計算合并以生成具有各向同性分辨率的3D數(shù)據(jù)集（克服了通常的軸向分辨率差的問題從其他視圖獲取信息）。因此，雙視圖diSPIM具有兩條（通常是對稱的）光路，包括兩個掃描儀和兩個攝像頭。
diSPIM“頭”可以安裝在各種倒置顯微鏡上，包括ASI的RAMM框架。diSPIM系統(tǒng)可以從各種系統(tǒng)集成商處獲得。各種開源和專有軟件包可用于數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理。不論所使用的系統(tǒng)集成商和軟件如何，大多數(shù)底層顯微鏡硬件都是相同的。
diSPIM目標的選擇是有限的，因為它們必須共同聚焦而不互相碰撞。diSPIM的物鏡是40倍水浸物鏡，NA為0.8（Nikon CFI Apo 40XW NIR）。奧林巴斯20x / 0.5物鏡是另一種可能性1）尼康10x / 0.3。ASI和Special Optics共同開發(fā)了一種適用于diSPIM的透明組織物鏡，該物鏡可以以平板形式或在12 mm球形包膜中對高達5 mm深的透明組織進行成像。單面系統(tǒng)（iSPIM）具有更大的靈活性，因為照明物鏡可以是低NA長WD物鏡。 sCMOS相機于SPIM成像。配備了Hamamatsu Flash4，Andor Zyla，PCO Edge和Photometrics Prime 95B相機的diSPIM系統(tǒng)。 ASI制造了緊湊的光纖耦合2D振鏡或“掃描儀”，它是系統(tǒng)的組成部分。掃描儀的原始版本通過在一個軸上進行快速掃描來創(chuàng)建光片，并使用另一個軸將光片移動通過樣品2）。還提供帶有圓柱透鏡的掃描儀版本，用于產生靜態(tài)光片。激發(fā)激光（或激光發(fā)射）的輸出被簡單地饋送到掃描儀中。使用2×1光學開關或雙輸出激光發(fā)射非常有幫助，這樣激發(fā)就可以全部引導到有源光路中的掃描儀。
對于需要環(huán)境控制的應用，diSPIM可以輕松地配備恒溫箱外殼和適當?shù)脑O備，以保持樣品的存活和快樂。 底部物鏡（倒置顯微鏡）通常具有較低的放大倍率物鏡和較便宜的用于定位樣品的照相機?？梢暂p松添加落射照明。
diSPIM“頭”可以安裝在各種倒置顯微鏡上，包括ASI的RAMM框架。diSPIM系統(tǒng)可以從各種系統(tǒng)集成商處獲得。各種開源和專有軟件包可用于數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理。不論所使用的系統(tǒng)集成商和軟件如何，大多數(shù)底層顯微鏡硬件都是相同的。
diSPIM目標的選擇是有限的，因為它們必須共同聚焦而不互相碰撞。diSPIM的物鏡是40倍水浸物鏡，NA為0.8（Nikon CFI Apo 40XW NIR）。奧林巴斯20x / 0.5物鏡是另一種可能性1）尼康10x / 0.3。ASI和Special Optics共同開發(fā)了一種適用于diSPIM的透明組織物鏡，該物鏡可以以平板形式或在12 mm球形包膜中對高達5 mm深的透明組織進行成像。單面系統(tǒng)（iSPIM）具有更大的靈活性，因為照明物鏡可以是低NA長WD物鏡。 sCMOS相機于SPIM成像。配備了Hamamatsu Flash4，Andor Zyla，PCO Edge和Photometrics Prime 95B相機的diSPIM系統(tǒng)。 ASI制造了緊湊的光纖耦合2D振鏡或“掃描儀”，它是系統(tǒng)的組成部分。掃描儀的原始版本通過在一個軸上進行快速掃描來創(chuàng)建光片，并使用另一個軸將光片移動通過樣品2）。還提供帶有圓柱透鏡的掃描儀版本，用于產生靜態(tài)光片。激發(fā)激光（或激光發(fā)射）的輸出被簡單地饋送到掃描儀中。使用2×1光學開關或雙輸出激光發(fā)射非常有幫助，這樣激發(fā)就可以全部引導到有源光路中的掃描儀。
對于需要環(huán)境控制的應用，diSPIM可以輕松地配備恒溫箱外殼和適當?shù)脑O備，以保持樣品的存活和快樂。 底部物鏡（倒置顯微鏡）通常具有較低的放大倍率物鏡和較便宜的用于定位樣品的照相機?？梢暂p松添加落射照明。
優(yōu)勢
像其他光片技術一樣，diSPIM僅照亮聚焦平面，因此是使活細胞和生物成像的理想選擇，因為它地減少了光漂白和光毒性效應。與傳統(tǒng)或旋轉盤共焦系統(tǒng)相比，軸向分辨率提高了約2倍，光漂白減少了10倍以上，速度可與旋轉盤媲美。查看與confocal的更詳細的比較。 與許多其他光片實現(xiàn)相比，diSPIM的主要優(yōu)勢在于，與倒置顯微鏡類似，樣品的安裝非常簡單。見的是，將標本放在24 x 50 mm的蓋玻片上，蓋玻片固定在一個特殊的腔室中，該腔室可容納浸漬介質。具有開放式安裝的其他燈片實現(xiàn)不具有各向同性分辨率。查看光片法的更詳細比較。 除了方便定位樣品外，底部物鏡還可用于光操縱（包括光遺傳學）或其他實驗技術。它也可以用來提供樣本的第三張獨立視圖。這種靈活性也是diSPIM的優(yōu)勢。 diSPIM是一種模塊化顯微鏡，因此可以根據(jù)您的特定需求進行多種變化和添加。NIH研究人員，Applied Scientific Instrumentation等正在探索各種新功能和改進。請參閱部分變體列表。 diSPIM系統(tǒng)可從多個系統(tǒng)集成商處購買。與其他商用輕型薄板解決方案相比，它們便宜且靈活。與定制的SPIM / LSFM系統(tǒng)相比，它們易于獲取，使用和維護。另請參見SPIM技術的更完整的技術比較。
配置
ASI提供了所有必要的硬件來實現(xiàn)diSPIM，這是一種靈活且易于使用的選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）實現(xiàn)，可在安裝在倒置（i）上的情況下實現(xiàn)樣品的雙視圖（d）。顯微鏡。diSPIM“頭”可以安裝在各種倒置顯微鏡上，包括ASI的RAMM框架。 ASI制造光機械元件，包括電動平臺，用于創(chuàng)建和移動光片的2D振鏡，以及壓電物鏡移動器。需要物鏡，激光和照相機來完成系統(tǒng)；用戶可以自己購買其他物品，使用出售diSPIM的各種系統(tǒng)集成商的服務，或通過ASI購買它們。 diSPIM已在蓋玻片上培養(yǎng)的細胞，嵌入在學院凝膠上的細胞c上成功進行了測試。線蟲和斑馬魚的胚胎，以及許多其他樣本。
