Caspase-8 Activity Assay Kit (Fluorometric)
Caspase-8活性檢測試劑盒（熒光法）
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 價格（元） |
Caspase-8活性檢測試劑盒（熒光法） | MX3233-20T | 20T | 930 |
Caspase-8活性檢測試劑盒（熒光法） | MX3233-100T | 100T | 2980 |
產(chǎn)品描述
Caspases（Cysteine-requiring Aspartate Proteases）是一個高度保守的半胱an酸蛋白酶家族，特異性識別底物中的天冬氨酸殘基，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。Caspases以潛在酶原的形式表達(dá)，通過自發(fā)蛋白分解機(jī)制或經(jīng)其他蛋白酶（通常是其他caspases）加工處理的方式被活化。人caspases可細(xì)分為三大功能組：細(xì)胞因子活化（caspase-1，-4，-5和-13），凋亡啟動（caspase-2，-8，-9和-10）和凋亡執(zhí)行（caspase-3，-6和-7）。
Caspase-8（Caspase 8），也稱為Mch5，MACH和FLICE，位于caspase級聯(lián)層次結(jié)構(gòu)的頂端，是“上游”成員或caspases的啟動家族。以無活性酶原的形式存在細(xì)胞內(nèi)，分子量55kDa。一旦募集到死亡受體胞漿結(jié)構(gòu)域（比如Fas），通過配體蛋白FADD，即被激活，形成一個由18kDa和12kDa亞基組成的二聚體，進(jìn)一步激活下游的caspases（-3，-6和-7），進(jìn)而切割關(guān)鍵的細(xì)胞底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡性死亡。
Caspase-8活性檢測試劑盒（熒光法）（Caspase-8 Activity Assay Kit, Fluorometric or Caspase-8 Fluorometric Assay Kit）以偶聯(lián)上發(fā)色基團(tuán)AFC的caspase-8序列特異性的多肽為底物。當(dāng)?shù)孜锉籧aspase-8剪切后，發(fā)色基團(tuán)被釋放出來，進(jìn)而用熒光酶標(biāo)儀來測定其熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長=485nm，發(fā)射波長=535nm）。通過計算RFU凋亡誘導(dǎo)組/RFU陰性對照組的比值來確定凋亡誘導(dǎo)組caspase-8的活化程度。
本品適用于培養(yǎng)細(xì)胞以及新鮮組織的caspase-8活性檢測。
產(chǎn)品包裝
編號 | 組分名稱 | 保存方法 | 貨號（規(guī)格） | |
MX3233-20T | MX3233-100T | |||
MX3233-A | Lysis Buffer 裂解緩沖液 | 2-8℃ | 5ml | 20ml |
MX3233-B | 2× Reaction Buffer 2×反應(yīng)緩沖液 | 2-8℃ | 2ml | 10ml |
MX3233-C | Caspase-8 Substrate Caspase-8底物 | -20℃避光 | 6μl | 30μl |
MX3233-D | 0.1M DTT | -20℃避光 | 60μl | 250μl |
保存與運(yùn)輸方法
保存：-20℃保存，1年有效。開盒后置Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于2-8℃保存。Caspase-8 Substrate和0.1M DTT需要避光凍存。
運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。
注意事項(xiàng)
1） Caspase-8 Substrate需避光保存和使用。
2） 某些凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的凋亡可能通過caspase-8非依賴的方式進(jìn)行，此種情況使用本品檢測的caspase-8活性無明顯變化，則，需要考慮凋亡機(jī)制中的其他信號通路。
3） 起始細(xì)胞數(shù)量需達(dá)3~5×106個或新鮮組織量達(dá)50~100mg，以保證達(dá)到測定所需的100~200μg蛋白量。Caspase-8的活性與細(xì)胞裂解后的蛋白含量有關(guān)，如測定的RFU值偏低，可通過適當(dāng)延長反應(yīng)時間來操作。但如果測定的RFU值依然不高，則要通過增加細(xì)胞數(shù)量或組織量的方法來提高蛋白量。
4） 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用方法
1. 需要的其他試劑和材料
儀器：低溫高速離心機(jī)、熒光酶標(biāo)儀、微量移液器、玻璃勻漿器（組織樣本）
耗材：1.5ml微量離心管、白色或黑色（不透明、平底）的96孔酶標(biāo)板
試劑：PBS、蛋白定量試劑（比如：Bradford法蛋白濃度測定試劑盒）、ddH2O
2. 試劑準(zhǔn)備
2.1 Lysis Buffer（含DTT）
于實(shí)驗(yàn)前，按每50μl Lysis Buffer 加入0.5μl DTT的比例準(zhǔn)備足量的裂解工作液，置于4℃或冰上待用。
2.2 2×Reaction Buffer（含DTT）
于使用前，按每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT的比例準(zhǔn)備足量的反應(yīng)工作液。
2.3 Caspase-8 Substrate工作液
將Caspase-8 Substrate從冰箱內(nèi)取出，置于室溫（或25℃水?。┦蛊涑浞秩诨退匐x心使其沉至管底。于使用前，按照19.5μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl Caspase-8 Substrate的比例準(zhǔn)備足量的Caspase-8 Substrate工作液。
3. 樣本準(zhǔn)備
3.1 細(xì)胞裂解
a）用合適方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時設(shè)立陰性對照組（不加誘導(dǎo)劑），收集3~5×106個細(xì)胞。
b）PBS洗滌細(xì)胞2次（2000rpm，離心5min），盡量吸盡PBS上清。
c）往離心的沉淀細(xì)胞中加入100μl預(yù)冷的Lysis Buffer（含DTT），吹打混勻。
d）置冰上裂解20~60min，其間渦旋振蕩3~4次，每次10s；或凍融2~3次。
e）4℃，10,000rpm離心1min。
f）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)移到新的EP管內(nèi)，置于冰上待用。
g）取少量上清（1~2μl），用常規(guī)方法（Bradford法）測定蛋白濃度。
3.2 組織裂解
a）取50~100mg組織置于培養(yǎng)皿內(nèi)，用手術(shù)剪剪碎成3mm×3mm左右的小塊，加入150~200μl預(yù)冷的Lysis Buffer（含DTT），用玻璃勻漿器上下手動勻漿15次，注意低溫操作。
b）將組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml預(yù)冷的離心管，10,000rpm，4℃離心5min。
c）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)移到新的EP管內(nèi)，置于冰上待用。
d）取少量上清（1~2μl），用常規(guī)方法（Bradford法）測定蛋白濃度。
4. Caspase-8活性檢測
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