雞小腸黏膜上皮細胞

包被條件 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 上皮細胞樣

傳代特性 可傳1代

消化液 0.25%yi蛋白酶

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

雞小腸黏膜上皮分離自小腸組織；小腸位于腹中，上端接幽門與胃相通，下端通過闌門與大腸相連，是食物消化吸收的主要場所。小腸盤曲于腹腔內(nèi)，上連胃幽門，下接盲腸，分為十二指腸、空腸和回腸三部分。小腸內(nèi)消化是至關(guān)重要的，因為食物經(jīng)過小腸內(nèi)胰液、膽汁和小腸液的化學(xué)性消化及小腸運動的機械性消化后，基本上完成了消化過程，同時營養(yǎng)物質(zhì)被小腸粘膜吸收了。小腸管壁由粘膜、粘膜下層、肌層和漿膜構(gòu)成。其結(jié)構(gòu)特點是管壁有環(huán)形皺襞，粘膜有許多絨毛，絨毛根部的上皮下陷至固有層，形成管狀的腸腺，其開口位于絨毛根部之間。絨毛和腸腺與小腸的消化和吸收功能關(guān)系密切；構(gòu)成腸腺的細胞有柱狀細胞、杯狀細胞、潘氏細胞和未分化細胞。柱狀細胞和內(nèi)分泌細胞與絨毛上皮相似，接近絨毛的柱狀細胞與吸收細胞相似，絨毛深部的柱狀細胞微絨毛少而短，不形成紋狀緣。小腸有三種功能即消化、吸收和分泌及運動功能，其中以吸收和分泌功能為主。平滑肌細胞的收縮是負責(zé)腸蠕動的動力，促使食物向下運動。腸黏膜上皮細胞是機體內(nèi)外環(huán)境的重要屏障，持續(xù)暴露于大量抗原中，也是機體面對病原微生物的道防線。因此，腸黏膜上皮細胞除有吸收、分泌和轉(zhuǎn)運等重要生理功能之外，在黏膜先天性和獲得性免疫防御機制中也起著重要作用。腸黏膜上皮細胞作為首先接觸抗原的細胞，在黏膜免疫反應(yīng)的起始階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，它決定黏膜免疫反應(yīng)的發(fā)生、性質(zhì)和強度。
方法簡介：

公司實驗室分離的雞小腸黏膜上皮采用中性dan白酶-膠原酶混合消化法結(jié)合差速貼壁法，并通過上皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：

公司實驗室分離的雞小腸黏膜上皮經(jīng)Cytokeratin-18免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

一、細胞培養(yǎng)

1取材 在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實驗?zāi)康亩ǎ?，?jīng)過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。2培養(yǎng) 將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。3凍存及復(fù)蘇（可參閱后面有關(guān)章節(jié)）為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。

二、原代細胞分離

凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細胞稱之為原代細胞。1懸浮細胞的分離方法組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。2實體組織材料的分離方法對于實體組織材料，由于細胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。

三、細胞增殖檢測技術(shù)

目前主要有兩種用于檢測細胞增殖能力的方法。一種是直接的方法，通過直接測定進行分裂

的細胞數(shù)來評價細胞的增殖能力。另一種是間接的方法，即細胞活力（cell viability）檢測方法，通過檢測樣品中健康細胞的數(shù)目來評價細胞的增殖能力。顯然，細胞活力檢測法并不能最終證明檢測樣品中的細胞是否在增殖。如細胞在某一培養(yǎng)條件下會自發(fā)啟動凋亡程序，但藥物的干擾可抑制凋亡的發(fā)生；這時若采用細胞活力檢測法，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細胞數(shù)量，但我們并不能從藥物干擾組細胞數(shù)大于對照組的事實說明藥物可促進細胞增殖的結(jié)論。所以最直接的證據(jù)應(yīng)該采用方法一。

取材：首先，用培養(yǎng)液濕潤所取的組織材料，并用鋒利的眼科剪去除附在其上的脂肪和結(jié)締組織。接著用平衡液（如PBS或Hanks液）漂洗，再用眼科彎剪將組織塊剪成小塊。多次用PBS或Hanks液漂洗，直到液體清亮、無油滴為止。

接種：用濕潤的吸管吸取切碎的組織塊，輕輕吹到培養(yǎng)瓶皿中，并按一定間距均勻放在培養(yǎng)瓶底壁上。注意不要過多，確保組織塊切面貼在培養(yǎng)瓶底壁上。

培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使瓶底朝上，在種植了組織塊一側(cè)的對側(cè)面加足培養(yǎng)液，避免組織塊與培養(yǎng)液接觸，然后塞緊瓶塞。將種植了組織塊的一側(cè)朝上，靜置于37℃培養(yǎng)箱中。待組織塊貼壁1到3小時后翻瓶，使貼壁的組織塊浸沒在培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置。換液：每隔2到3天更換一次培養(yǎng)液，或者根據(jù)培養(yǎng)瓶種顏色的變化確定換液時間。

一、原代細胞計數(shù)

將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。

將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。

靜置3分鐘。

鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：

細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/ 4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。

二、原代細胞活力

將細胞懸液以0.5ml加入試管中。

加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。

吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計細胞活力。

死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細胞計數(shù)合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。