如今，單細(xì)胞基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究不再是遙不可及。利用新興的微流體方法和分子生物學(xué)技術(shù)，研究人員逐漸能從群體噪音中提取單細(xì)胞信號(hào)。《Genome Technology》雜志請(qǐng)來了一些專家，來分享他們?cè)趩渭?xì)胞qPCR分析上的經(jīng)驗(yàn)。通過一問一答的形式，希望能為您的研究帶來一點(diǎn)啟發(fā)。
Q5：您如何定量單細(xì)胞qPCR結(jié)果？
Mikael Kubista（TATAA生物中心）
單細(xì)胞表達(dá)譜數(shù)據(jù)的分析包括三個(gè)步驟：normalization、scaling和clustering。用參考基因的表達(dá)來均一化（normalization）不適用于單細(xì)胞，因?yàn)榛虮磉_(dá)存在大的、不相關(guān)的變化。我們?cè)谠鹊奈恼轮姓故玖诉@一點(diǎn)，自那以后，幾乎所有的基因和細(xì)胞都證明了這一點(diǎn)，除了mRNA代謝不活躍的細(xì)胞（如卵母細(xì)胞）外。更好的做法是均一化每個(gè)細(xì)胞的表達(dá)，也就是直接比較測(cè)得的量。這是zui直觀的。當(dāng)然，這種方法不能說明樣品處理過程中的損失，但我們發(fā)現(xiàn)那通常可忽略不計(jì)。如果您擔(dān)心樣品處理，那么上面提到的RNA加標(biāo)可用于測(cè)定產(chǎn)量和重復(fù)性。
對(duì)于表達(dá)譜分析，數(shù)據(jù)可以多種方法進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)可能是unscaled、mean-centered或autoscaled。Mean centering（減去平均值）和autoscaling（減去平均值并除以標(biāo)準(zhǔn)偏差）可平衡分析中標(biāo)志物的權(quán)重。對(duì)于單細(xì)胞，我們有時(shí)候也覺得Mean centering和autoscaling很有用。
Anders Ståhlberg（哥德堡大學(xué)）
如果避免了預(yù)擴(kuò)增，數(shù)據(jù)可轉(zhuǎn)換成的cDNA數(shù)量，否則數(shù)據(jù)分析可以Cq值來開展，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本水平呈對(duì)數(shù)正態(tài)分布。一開始，可以各種方法對(duì)數(shù)據(jù)作圖，此外，基本的統(tǒng)計(jì)分析也應(yīng)開展（如陽性細(xì)胞的數(shù)量、平均值和偏差）。細(xì)胞數(shù)量測(cè)定通常是以驗(yàn)證過的參考基因來均一化的。這種策略在單細(xì)胞分析中應(yīng)避免，因?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞中的所有轉(zhuǎn)錄本水平隨時(shí)間變化。我們發(fā)現(xiàn)，校正分析和無監(jiān)督算法（如Kohonen self-organizing maps）對(duì)定義亞群和基因網(wǎng)絡(luò)很有用。
Finn-Arne Weltzien（挪威獸醫(yī)學(xué)院）
我們?cè)诶脝渭?xì)胞qPCR進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)很小心。我們通常只進(jìn)行定性分析。如果我們定量，我們會(huì)利用目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)參考基因的拷貝數(shù)。
Weiwen Zhang（亞利桑那州立大學(xué)，現(xiàn)在天津大學(xué)）
對(duì)于每個(gè)單細(xì)胞，我們對(duì)目的基因和參考基因進(jìn)行qPCR分析，如原核生物的16s rRNA和真核生物的28s或actin。不過，我們也注意到，這些常用參考基因的表達(dá)水平在單細(xì)胞中也差別很大，對(duì)大量細(xì)胞qPCR的標(biāo)準(zhǔn)定量法則也須特別謹(jǐn)慎。在大部分情況下，我們報(bào)告原始和均一化的Ct值，并使用它們進(jìn)行單細(xì)胞qPCR結(jié)果的定量。
Q6：您分析時(shí)使用哪些生物信息學(xué)工具？
Mikael Kubista（TATAA生物中心）
我們采用GenEx進(jìn)行單細(xì)胞分析。事實(shí)上，我們?cè)谒衠PCR數(shù)據(jù)分析中使用GenEx。GenEx強(qiáng)大、用戶友好，且支持所有的qPCR儀器，這讓從實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)入數(shù)據(jù)和注釋很簡(jiǎn)單。GenEx有著的數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估，對(duì)單細(xì)胞研究很重要，以及強(qiáng)大的單細(xì)胞表達(dá)譜工具。它有著用戶友好的界面，即使是沒有經(jīng)驗(yàn)的用戶也能使用那些強(qiáng)大的工具。
Anders Ståhlberg（哥德堡大學(xué)）
我使用GenEx和SPSS開展數(shù)據(jù)分析。
Weiwen Zhang（亞利桑那州立大學(xué)，現(xiàn)在天津大學(xué)）
對(duì)于幾十個(gè)基因的分析，我們采用ANOVA student t-test或其他簡(jiǎn)單的統(tǒng)計(jì)學(xué)工具。不過，如果以擴(kuò)增的單細(xì)胞cDNA作為模板，分析幾千個(gè)基因，則可能需要更*的生物信息學(xué)工具。
會(huì)員1.png)