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　　本植物RNA提取試劑盒，其原理*不同于異硫氰酸胍/酚/氯仿提取方法，克服了后者不能區(qū)分RNA （本質(zhì)上是多糖）和其他植物多糖的缺點(diǎn)，能將RNA和其他植物多糖分開(kāi)，同時(shí)還能有效去除多酚和其他植物次級(jí)代謝成份。其有效性在近五十多種各類植物（見(jiàn)附錄，包括十分棘手的松柏類植物）中得到驗(yàn)證。

　　1. 適用于絕大多數(shù)植物，從五十多種植物材料中都成功提取到了總RNA，其中包括松針、柏樹(shù)、香蕉等用胍/酚/氯仿方法未能提取到RNA的植物（注：部分植物組織，如果實(shí)， RNase含量*, 需要另外加RVC抑制其活性）。

　　2. 操作簡(jiǎn)單快速，zui短可以只需要約十五分鐘，可以全在室溫下進(jìn)行。

　　3. 得到的RNA平均 OD260/280在1.9左右，可直接用于RT-PCR和Northern等研究。

　　成份

　　50 次（3080-50）

　　250 次（3080-250）

　　溶液A

　　50 mL

　　250 mL

　　溶液B

　　15 mL

　　75 mL

　　溶液C

　　25 mL

　　125 mL

　　溶液D

　　25 mL

　　125 mL

　　使用手冊(cè)

　　1份

　　1份

　　常溫運(yùn)輸，4℃保存，有效期一年。

　　氯仿、75%乙醇、RNA溶解液。

　　1. 準(zhǔn)備

　　a） 估算試劑和組織細(xì)胞的用量并準(zhǔn)備足夠的氯仿、75%乙醇和RNA溶解液（如RNASAVER、無(wú)RNase的水或有滅活殘留RNase活性的液相RNase清除劑）。每次微量提取一般需要100-200 mg植物葉片、或50-100 mg植物種子、或200-500 mg植物果實(shí)。

　　b） 溶解溶液A沉淀。溶液A在4℃放置后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，使用前必須放在65℃水浴使沉淀*溶解。

　　2、 勻漿

　　a） 先將新鮮植物組織剪切成小塊（保存在RNALOCKER中的植物組織需用紙吸去RNALOCKER液體后再剪切成小塊），放入10-15 mL塑料離心管中，加入1 mL溶液A，然后用勻漿器勻漿5-20秒，將不超過(guò)1 mL的勻漿液轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 mL塑料離心管中（可以不必轉(zhuǎn)移非液體的細(xì)胞碎片）。勻漿時(shí)會(huì)產(chǎn)生泡沫，但不影響提取效果。有的植物組織（果實(shí)）含有大量水份，勻漿液會(huì)多于1 mL，轉(zhuǎn)移時(shí)也只取1 mL。

　　b） 如果用硯磨法破碎植物組織，需將植物組織浸泡在1 mL溶液A中再硯磨，盡量避免植物組織跟空氣直接接觸，然后將硯磨物轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中。

　　3、 *次分相

　　a） 在裝有裂解物的離心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自備氯仿，用手上下顛倒或振蕩器振蕩30秒混勻，此時(shí)溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時(shí)必須使管底溶液震蕩起來(lái)。

　　b） 室溫12000-15000 g離心5分鐘，兩相間將有約5-10毫米厚的細(xì)胞破碎物。

　　c） 將上清液（約0.8 mL）轉(zhuǎn)移到另一干凈的1.5 mL塑料離心管中，下層有機(jī)相和中間層含有DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，避免觸及或吸取。留下100 μL上清液不取。

　　4、 第二次分相

　　a） 在上清液中加入0.5 mL的溶液C和0.2 mL的自備氯仿，用手上下顛倒或振蕩器振蕩30秒混勻，此時(shí)溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時(shí)必須使管底溶液震蕩起來(lái)。

　　b） 室溫12000-15000 g離心3分鐘，兩相間將有白色膜狀物（蛋白質(zhì)）形成。

　　c） 將上清液（約1 mL）轉(zhuǎn)移到另一干凈的1.5 mL塑料離心管中,避免觸及或吸取有機(jī)相及其上面的白色膜狀物。

　　5、 沉淀

　　a） 在上清液中加入0.5倍體積的溶液D，用手上下顛倒或振蕩器振蕩30秒混勻，此時(shí)溶液呈白色渾濁狀。振蕩器振蕩時(shí)必須使管底溶液震蕩起來(lái)。如果提取 50 mg以下的微量植物組織樣品，在此步加入天恩澤的微量助沉劑RNADOWN。

　　b） 室溫12000-15000 g離心3-5分鐘，RNA將在管底形成白色沉淀（約黃豆大?。?。如果組織樣品量少或需要提高RNA回收率，也可以延長(zhǎng)離心時(shí)間到20-30分鐘。

　　c） 小心移棄上清液，避免觸及管底R(shí)NA沉淀。

　　注意：如果加入溶液D離心后沉淀漂浮在上面，說(shuō)明植物糖份多，溶液比重大，可以少加植物樣品，也可以適當(dāng)加無(wú)RNase的水稀釋直到沉淀能夠沉下去為止。如果離心后管底有類似氯仿的相出現(xiàn)，說(shuō)明上一步離心時(shí)間不夠或取上清時(shí)取到了下層的有機(jī)相，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或取上清時(shí)留下約100 μL不取或在第四步時(shí)加0.3 mL的自備氯仿。

　　6、 *次清洗

　　a） 在離心管中加入1mL 75%的乙醇，振蕩器上振蕩混均30秒。

　　b） 室溫12000-15000 g離心1分鐘，RNA將在管底形成細(xì)小沉淀（約芝麻大小）。

　　c） 小心吸棄上清液,注意不要吸棄RNA沉淀。

　　7、 第二次清洗

　　a） 重復(fù)第六步一次。

　　b） 短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留液,注意不要吸棄沉淀。此步將有效去除殘留的乙醇，否則后續(xù)反應(yīng)會(huì)受到影響。

　　8、 溶解

　　a） 加入適量（一般為20-100 μL） RNA溶解液使RNA沉淀溶解，存放于-80℃或立即使用。千萬(wàn)不要用真空離心法使RNA沉淀過(guò)于干燥,否則RNA將變得十分難溶。

　　9、 檢測(cè)

　　a） RNA完整性的電泳檢測(cè)

　　如果需要做Northern雜交，強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行RNA電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是簡(jiǎn)單檢測(cè)，可以使用TAE或天恩澤的SuperBuffer-2 DNA/RNA兩用快速電泳液，但文獻(xiàn)報(bào)道必須使用變性上樣液（BioTechniques，9：558，1990）。普通DNA上樣液不含變性劑，也沒(méi)經(jīng)過(guò)去RNase處理，所以不要使用。

　　尤其需要注意的是不要使用TBE進(jìn)行RNA電泳，因?yàn)門BE所含硼酸是研究多糖的經(jīng)典方法----硼酸絡(luò)合法中的關(guān)鍵成分，硼酸通過(guò)與RNA核糖中的羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成RNA分子內(nèi)或RNA分子間的絡(luò)合復(fù)合物，使同樣長(zhǎng)度的RNA具有不同的泳動(dòng)速度，電泳條帶彌散，同時(shí)有大的RNA絡(luò)合復(fù)合物遲留在加樣孔中（一般會(huì)誤以為是基因組DNA污染）。RNA分子內(nèi)或RNA分子間的絡(luò)合物的形成的多少和比例又與硼酸與RNA的數(shù)量比例有關(guān)，而RNA樣品中污染的其他多糖（如植物中提取的RNA）也會(huì)參與此反應(yīng)，使硼酸對(duì)RNA電泳的影響更復(fù)雜，所以TBE對(duì)RNA電泳的影響沒(méi)有規(guī)律性和重復(fù)性。有的樣品可以使用有的又不行，是避免使用。

　　由于動(dòng)物細(xì)胞中70-80%的RNA為rRNA，后者又由28S （約4800 nt），18S （約1900 nt）和5.8S （約120 nt）三種組成，所以變性膠電泳后應(yīng)該在UV下看見(jiàn)三條清晰的rRNA帶。由于核酸長(zhǎng)度與結(jié)合EB的數(shù)量成正比（當(dāng)然還與RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，雙鏈部分結(jié)合能力比單鏈部分強(qiáng)），所以28S rRNA條帶的熒光強(qiáng)度一般比18S rRNA條帶的熒光強(qiáng)度強(qiáng)1.5-2.3倍。如果這兩條rRNA帶不清晰或比例小于此范圍則表示RNA有降解（因?yàn)榇蟮腞NA被酶降解的可能更大）。

　　跟動(dòng)物一樣，植物果實(shí)和種子的RNA一般有三條電泳帶，但植物葉片的RNA有四條或更多rRNA帶，多余的RNA來(lái)源于葉片中大量存在的葉綠體。

　　b） RNA產(chǎn)量產(chǎn)率測(cè)定

　　將5-10 μL RNA溶于TE緩沖液中（pH7.5-8.2之間）檢測(cè)其在OD260的光吸收。通過(guò)光吸收可以得出RNA濃度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），進(jìn)而計(jì)算出RNA的產(chǎn)量（濃度X體積）和產(chǎn)率（RNA產(chǎn)量/組織用量）。

　　注意不要將RNA稀釋在DEPC水中檢測(cè)OD260和OD280，否則光吸收比在TE中測(cè)得的低10%-15%，因?yàn)楹怂峁馕崭芤簆H相關(guān)，而DEPC水中的DEPC高壓分解后產(chǎn)生的CO2 與水反應(yīng)生成碳酸，使溶液pH降低進(jìn)而降低RNA的光吸收。RNA的產(chǎn)率還隨組織的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和組織的種類不同而不同，100 mg種子的RNA產(chǎn)量一般為100-120 μg，100 mg葉片為30-60 μg, 100 mg果實(shí)為20-40 μg。

　　c） RNA純度測(cè)定

　　無(wú)污染的總RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之間（具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān)），OD260/OD230一般在2.0-2.3之間，如果低于或高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)或多糖的污染，但一般不影響RT-PCR等反應(yīng)。蛋白質(zhì)污染可以通過(guò)酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA和多糖污染可以分別用天恩澤的DNA Erasol 和PS Erasol去除。

　　植物RNA提取影響因素

　　因素

　　說(shuō)明

　　對(duì)策

　　多酚

　　多存在于植物果實(shí)和針葉植物中。勻漿時(shí)釋放出來(lái)，氧化成醌（多為褐色）后能與RNA共價(jià)結(jié)合，使RNA在提取過(guò)程中進(jìn)入酚相而丟失。

　　還原法；螯合法；硼砂法；沉淀法；丙酮法；低pH法。

　　多糖

　　廣泛存在于何種組織。其多羥基特點(diǎn)與RNA相似。能去除的多糖會(huì)裹走部分RNA而降低其產(chǎn)量；不能去除的多糖與RNA共沉淀，使溶液粘稠，同時(shí)還會(huì)抑制后續(xù)的RT等酶反應(yīng)。

　　高鹽沉淀法；低醇沉淀法；CsCl梯度離心法等

　　蛋白質(zhì)

　　包括植物*的RNase和多酚氧化酶。

　　Proteinase K降解法；抑制劑法；高氯酸鈉沉淀法；變性滅活法。

　　次級(jí)代謝物

　　多存在于高等植物成熟組織中，成分復(fù)雜，水溶。能與RNA共沉淀，抑制后續(xù)的酶反應(yīng)。

　　CsCl梯度離心法

　　來(lái)源于植物組織RNA提取難點(diǎn)及對(duì)策（生物技術(shù)通訊，1999。李宏等）。

　　Q：上樣孔里的紅色熒光物一定是污染的基因組DNA嗎？

　　A：不是。用TAE或TBE電泳液和非變性膠電泳RNA時(shí)容易產(chǎn)生此現(xiàn)象，天恩澤初步研究發(fā)現(xiàn)大部分紅色熒光物是變性不充分的單鏈RNA通過(guò)堿基互補(bǔ)或通過(guò)硼酸絡(luò)合（如果使用TBE作電泳液的話）形成的復(fù)合物，加RNase處理后，這些紅色熒光物一般會(huì)消失。為避免此現(xiàn)象，建議使用甲醛變性膠電泳。如果需要使用非變性膠，也必須在上樣前使RNA變性。使用天恩澤優(yōu)化的上樣/變性/染色三用溶液RNAON可以使RNA在非變性膠上電泳時(shí)也有較好分辨率。使用非變性膠時(shí)，可以使用TAE或超快電泳液SuperBuffer-2,不要使用TBE緩沖液，因?yàn)門BE中的硼酸能與RNA的多羥基形成復(fù)合物，RNA很難形成銳利的條帶。

　　Q：如何確認(rèn)和去處除污染的基因組DNA？

　　A：如果懷疑有DNA污染，可以用RNase處理RNA樣品，然后再電泳。如果上樣孔里的紅色熒光物不消失，則表示是基因組DNA污染。進(jìn)一步確認(rèn)可以使用PCR擴(kuò)增法。去除污染的DNA可以使用非酶的DNA去除劑DNA Erasol或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase一般都有殘留的RNase污染，所以必須嚴(yán)格按照廠家提供的使用手冊(cè)進(jìn)行操作。

　　Q：為何提取的RNA電泳時(shí)帶型不清楚或根本沒(méi)有條帶？

　　A：可能原因：1、電泳沒(méi)有使用MOPS緩沖液+甲醛變性膠；2、沒(méi)有使用RNA的上樣液或使用的RNA的上樣液放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；3、植物組織樣品中RNase很多，可以使用RVC（部分植物果實(shí)需要此處理）；4、植物組織中含多酚等影響提取的物質(zhì)（如松柏等植物），可以在溶液A中加入終濃度為0.1 M的硼氫化鈉。