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純化線粒體腫脹光度法測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書

主要用途

純化線粒體腫脹光度法測(cè)定試劑是一種旨在通過(guò)光度法檢測(cè)線粒體的光散射性變化，即吸光峰值的變化，來(lái)實(shí)時(shí)分析和觀察線粒體基質(zhì)容積或線粒體膨脹性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種純化線粒體膨脹程度的定量檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，活體檢測(cè)，分辨率高，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

線粒體容積變化是衡量線粒體活性的基本參數(shù)。線粒體應(yīng)對(duì)細(xì)胞對(duì)于藥物、凋亡誘導(dǎo)、細(xì)胞周期變化等反應(yīng)采取的活性變化，包括膜電位、氧消耗、以及膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）功能等的改變。線粒體基質(zhì)容量（mitochondrial matrix volume）成為檢測(cè)線粒體活性和功能的指標(biāo)。一旦各種因素包括凋亡刺激、活性氧影響導(dǎo)致線粒體膜通道孔開(kāi)放或膜電位的消失，而導(dǎo)致線粒體容積增大，即線粒體膨脹（mitochondrial swelling），使線粒體的光散射性（light scattering）降低，通過(guò)分光光度儀520nm波長(zhǎng)的吸光峰值的變化，定量分析線粒體的膨脹程度。該波長(zhǎng)區(qū)域可以避免細(xì)胞色素和蛋白質(zhì)的干擾。  

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A）                       20毫升

膨脹液（Reagent B）                      500微升

產(chǎn)品說(shuō)明書               1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

比色皿96孔板：用于線粒體光度分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于線粒體光度定量分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)520nm，間隔30秒測(cè)讀1次，持續(xù)10分鐘至30分鐘，并置零

• 樣品膨脹度檢測(cè)

• 準(zhǔn)備好待測(cè)的純化線粒體樣品：對(duì)照樣品和處理樣品
• 分別移取20微升線粒體樣品（總量為200微克）到比色皿或96孔板的對(duì)應(yīng)孔里
• 分別加入170微升緩沖液（Reagent A），混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)520nm）：獲得0分鐘初始讀數(shù) 
• 動(dòng)態(tài)測(cè)讀1分鐘或室溫下靜置1分鐘
• 即刻分別加入10微升膨脹液（Reagent B） 
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)520nm）：動(dòng)態(tài)記錄10分鐘吸光值變化或設(shè)定時(shí)間點(diǎn)記錄實(shí)際吸光值
• 獲得實(shí)際吸光讀數(shù)：0分鐘讀數(shù)-10分鐘吸光讀數(shù)――實(shí)際吸光讀數(shù)高，表明線粒體膨脹度高
• 或構(gòu)建線粒體膨脹-藥物濃度關(guān)系曲線：縱座標(biāo)（Y）為實(shí)際吸光讀數(shù)，橫座標(biāo)（X）為藥物濃度

二、誘導(dǎo)劑篩選檢測(cè)

• 準(zhǔn)備好待測(cè)的純化線粒體樣品
• 移取20微升線粒體樣品（總量為200微克）到比色皿或96孔板的對(duì)應(yīng)孔里
• 加入170微升緩沖液（Reagent A），混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)520nm）：獲得0分鐘初始讀數(shù) 
• 動(dòng)態(tài)測(cè)讀1分鐘或室溫下靜置1分鐘
• 即刻加入10微升用戶自備的待測(cè)誘導(dǎo)劑，混勻（注意：可以設(shè)定不同濃度梯度）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)520nm）：動(dòng)態(tài)記錄10分鐘吸光值變化或設(shè)定時(shí)間點(diǎn)記錄實(shí)際吸光值――吸光值降低，表明誘導(dǎo)劑作用增強(qiáng)
• 構(gòu)建線粒體膨脹誘導(dǎo)曲線：縱座標(biāo)（Y）為實(shí)際吸光值 ，橫座標(biāo)（X）為時(shí)間（分鐘）
• 或構(gòu)建線粒體膨脹-誘導(dǎo)劑濃度關(guān)系曲線：縱座標(biāo)（Y）為實(shí)際吸光值，橫座標(biāo)（X）為誘導(dǎo)劑濃度

三、抑制劑篩選檢測(cè)

• 準(zhǔn)備好待測(cè)的純化線粒體樣品
• 移取20微升線粒體樣品（總量為200微克）到比色皿或96孔酶標(biāo)板的對(duì)應(yīng)孔里
• 加入160微升室溫預(yù)熱的緩沖液（Reagent A），混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)520nm）：獲得0分鐘初始讀數(shù) 
• 動(dòng)態(tài)測(cè)讀1分鐘或室溫下靜置1分鐘
• 加入10微升用戶自備的待測(cè)抑制劑，混勻（注意：可以設(shè)定不同濃度梯度）
• 動(dòng)態(tài)測(cè)讀2分鐘或室溫下靜置2分鐘
• 即刻加入10微升膨脹液（Reagent B），混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)520nm）：動(dòng)態(tài)記錄10分鐘吸光值變化或設(shè)定時(shí)間點(diǎn)記錄實(shí)際吸光值――吸光值不變，表明抑制劑作用增強(qiáng)
• 或構(gòu)建線粒體膨脹-抑制劑濃度關(guān)系曲線：縱座標(biāo)（Y）為實(shí)際吸光值，橫座標(biāo)（X）為抑制劑濃度

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為50次操作
• 本產(chǎn)品用于線粒體膨脹度檢測(cè)、以及誘導(dǎo)劑和抑制劑篩選
• 操作時(shí)，須戴手套
• 使用時(shí)，避免污染母液，尤其是緩沖液（Reagent A）
• 線粒體樣品中忌用磷酸鹽、EDTA、鈣鎂離子等處理
• 建議使用未經(jīng)誘導(dǎo)或抑制處理的樣品作為對(duì)照樣品