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上海哈靈生物科技有限公司
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質(zhì)粒小量抽提試劑盒
2014-12-10 閱讀(602)
| 提 供 商 | 上海哈靈生物科技有限公司 | 資料大小 | 213.3KB |
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質(zhì)粒小量抽提試劑盒使用說(shuō)明：
1. 取過(guò)夜菌1.5毫升，5000g離心1分鐘收集細(xì)菌沉淀，棄上清。再重復(fù)一次，每管共收集3毫升過(guò)夜菌沉淀。
通常大腸桿菌宜用LB培養(yǎng)過(guò)夜(16小時(shí)左右)至OD值為2-4。建議5000g(通常為5000rpm左右)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或離心速度過(guò)快會(huì)使沉淀過(guò)于緊密，不利于加入溶液I后散開(kāi)沉淀。直接倒掉上清，再倒入約1.5毫升菌液并重復(fù)上述操作，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。如果細(xì)菌密度明顯偏低，可考慮使用更多菌液，再重復(fù)上述操作1-2次。對(duì)于高拷貝質(zhì)粒所用菌量一般不能超過(guò)5毫升，對(duì)于低拷貝質(zhì)粒所用菌量一般不能超過(guò)10毫升。過(guò)量的細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的裂解不充分。 粒轉(zhuǎn)細(xì)胞效果，建議使用
2. 每管加入250微升溶液I，重懸細(xì)菌沉淀。確保沉淀*散開(kāi)，無(wú)可見(jiàn)細(xì)菌團(tuán)塊。
確認(rèn)溶液I中已經(jīng)添加了RNase A。zui高速度vortex 5-10秒或更長(zhǎng)時(shí)間，懸起沉淀。一定要充分混勻，對(duì)著光亮處觀察應(yīng)呈
均勻的懸濁液，無(wú)明顯細(xì)菌團(tuán)塊或絮塊。如果沒(méi)有vortex，可以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開(kāi)或用手指把沉淀彈開(kāi)。
3. 每管加入250微升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使細(xì)菌*裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會(huì)導(dǎo)致基因組DNA斷裂，易導(dǎo)致zui終所得質(zhì)粒被基因組DNA污染。顛倒4-6次后，溶
液應(yīng)變得透明，無(wú)團(tuán)塊或絮狀物。如果加入溶液I后細(xì)菌沒(méi)有*散開(kāi)，那么顛倒4-6次后，可能還會(huì)有團(tuán)塊或絮狀物。遇
到有少量團(tuán)塊或絮狀物產(chǎn)生的情況，可以增加顛倒次數(shù)3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時(shí)間不可超過(guò)5分鐘。
4. 每管加入350微升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見(jiàn)白色絮狀物產(chǎn)生。
切勿vortex！顛倒次數(shù)也不宜過(guò)多，否則易導(dǎo)致zui終所得質(zhì)粒的質(zhì)量下降。
5. zui高速(13,000rpm左右)室溫離心10分鐘。
離心后會(huì)產(chǎn)生白色沉淀。離心時(shí)準(zhǔn)備好下一步需使用的質(zhì)粒純化柱，廢液收集管，并在純化柱上做好標(biāo)記。
6. 將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)。zui高速離心30-60秒，倒棄收集管內(nèi)液體。
質(zhì)粒倒入質(zhì)粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。
7. 在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入750微升溶液IV，zui高速離心30-60秒，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。
加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。
8. zui高速再離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇*揮發(fā)。
注意：倒棄收集管內(nèi)液體后再離心，才能*去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會(huì)影響質(zhì)粒的質(zhì)量。
9. 將質(zhì)粒純化柱置于1.5毫升離心管上，加入50微升溶液V至管內(nèi)柱面上，放置1分鐘。
溶液V 需要直接加至管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果不慎將溶液 V 沾在管壁上，一定要震動(dòng)管子，使液體滑
落到管底，以便被純化柱吸收。也可以用重蒸水或 MiliQ 級(jí)純水替代溶液V，但是水的pH 應(yīng)不小于6.5。溶液V 加入后
放置時(shí)間稍長(zhǎng)，對(duì)于增加質(zhì)粒產(chǎn)量會(huì)略有幫助。
10. zui高速離心1分鐘，所得液體即為高純度質(zhì)粒。
通常所得質(zhì)粒濃度為0.1-0.3mg/ml左右。如果想得到高濃度的質(zhì)粒，可以采用常規(guī)的乙醇沉淀方法濃縮質(zhì)粒。
