細(xì)胞凋亡的具體步驟

實(shí)驗(yàn)步驟

懸浮細(xì)胞：

1）收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 l?g/ml，需預(yù)試尋找*稀釋度，1:10-1:20）；③需檢測物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100?（儲存液100 1640）。

2）置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）

4）離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。

5）同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。

貼壁細(xì)胞：

1.收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2.5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況

3.5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5.每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

6.終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

7.同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）