產(chǎn)品及特點

構(gòu)建cDNA文庫、蛋白質(zhì)的體外翻譯和RT-PCR方法檢測稀有的mRNA等研究常常需要從總RNA中分離mRNA，mRNA只占總RNA的1%左右，但由于帶poly（A）尾巴，所以可以通過與Oligo（dT）纖維素的親和結(jié)合而與其他RNA（如rRNA、tRNA等）分離開。本產(chǎn)品專門用于從動物組織中提取mRNA，它具有下列特點：

1. 一站式，由柱式動物RNA提取試劑和mRNA提取試劑兩個產(chǎn)品整合而成，即開即用，非常方便。

2. 一次可以處理50-100 mg的動物組織，能得到約10-15 ug總RNA，從中可得0.1-0.5 ug 左右的mRNA。

3. Oligo（dT）纖維素吸附能力強，每克可以吸附50-80 OD的mRNA，相當(dāng)于2000-3000 ug mRNA。

4. mRNA提取過程操作簡單，只需要離心就可以完成，免去了常規(guī)的灌柱、洗柱等繁瑣操作。

5. 得到的mRNA可以直接用于構(gòu)建cDNA文庫、蛋白質(zhì)的體外翻譯和RT-PCR。

規(guī)格及成分

運輸及保存

常溫運輸， Oligo（dT）纖維素-20℃保存，RNA洗液4℃保存，其余產(chǎn)品可以室溫放置。本產(chǎn)品有效期一年。

自備試劑

氯仿、75%乙醇。

使用方法

一：用柱式動物RNAout提取總RNA

下面的操作步驟是針對在1.5 mL塑料離心管中進行的微量提取的，如果處理樣品量大，請按比例增加各成份的用量并使用大的離心管和離心機。

1. 新鮮配制裂解液。將溶液A和溶液B按1:1的比例混合，然后根據(jù)組織細(xì)胞類型的不同分為下面及種情況使用。注意：溶液A和溶液B混合后必須立即使用，不要放置，否則會產(chǎn)生沉淀。

a） 對貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)液，在每10平方厘米細(xì)胞中加入1 mL新鮮配制的裂解液，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解。

b） 對懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，在每1-5×106懸浮細(xì)胞中加入1 mL新鮮配制的裂解液，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解。如果是fibroblasts或carcinoma cell，1 mL新鮮配制的裂解液的細(xì)胞使用量不要超過1×106個細(xì)胞。

c） 對新鮮組織：先將剪切成小塊新鮮組織或液氮保存的組織放入10 mL或15 mL塑料離心管中，每50-100 mg組織加1 mL新鮮配制的裂解液，用勻漿器勻漿30秒左右。對肝、脾、胰、腎等細(xì)胞分裂十分旺盛的組織（細(xì)胞中含大量正在復(fù)制的DNA），建議組織的使用量不要超過50 mg/ mL裂解液，否則十分容易產(chǎn)生DNA污染。

d） 對RNALOCKER保存組織：先用紙吸去RNALOCKER液體后再剪切成小塊，其余操作同新鮮組織的處理。

2. 將裂解物轉(zhuǎn)移至一個干凈的1.5 mL塑料離心管中，然后加入0.2倍體積的自備氯仿（1 mL裂解物需0.2 ml氯仿），振蕩器上充分振蕩混均30秒。

3. 12000-15000 g室溫離心3-5分鐘。

4. 將上清液（約0.6-0.8 mL）轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。注意：離心后下層有機相和中間層含有DNA和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和DNA污染。為保險起見，可以留下100 uL上清液不取。同時吸取上清時緩慢進行，否則容易吸出交界面的不可見的絲狀DNA。

5. 13000-15000 g室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。

6. 加0.5 mL通用洗柱液到離心吸附柱中，室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。

7. 再加0.5 mL通用洗柱液到離心吸附柱中，室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。

8. 室溫離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留的通用洗柱液會影響RNA的使用。

9. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一自備的RNase-free收集管中，加入50 uL RNA洗脫液。

10. 室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為RNA樣品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

11. RNA完整性的電泳檢測：如果需要做Northern雜交，強烈建議用戶使用甲醛變性膠進行RNA電泳，因為非變性膠不能分離所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。

12. RNA產(chǎn)量產(chǎn)率測定：將5-10 μL RNA溶于TE緩沖液中（pH7.5-8.2之間）檢測其在OD260的光吸收。通過光吸收可以得出RNA濃度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），進而計算出RNA的產(chǎn)量（濃度X體積）和產(chǎn)率（RNA產(chǎn)量/組織用量）。

13. RNA純度測定：無污染的總RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之間（具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān)），高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)污染，但一般不影響RT-PCR等反應(yīng)。

二：從總RNA中提取mRNA 

本產(chǎn)品提供本產(chǎn)品提供25 mg Oligo（dT）纖維素，每克Oligo（dT）纖維素能夠結(jié)合50-80 OD的mRNA。

1. 在一個1.5 mL塑料離心管中稱取1 mg Oligo （dT）纖維素。將0.5 mL結(jié)合液加入到一管裝有1 mg Oligo （dT）纖維素的離心管中，混勻后室溫放置5分鐘。也可以將250 uL 結(jié)合液加入到裝有25 mg Oligo（dT）纖維素的離心管中，每次取10 uL（相當(dāng)于1 mg Oligo （dT）纖維素）與0.5 mL結(jié)合液混勻，室溫放置5分鐘。剩余部分放-80℃保存。

2. 200-2000 g離心30秒，小心吸棄上清后留Oligo （dT）纖維素沉淀待用。

3. 將在*節(jié)中提取的兩管相同的總RNA（每個樣品用50 uL洗脫）混合在一起得到總RNA 100 uL，65℃加熱 5分鐘。

4. 加入等體積的結(jié)合液，混勻后冷卻到室溫后，全部轉(zhuǎn)移到裝有Oligo（dT）纖維素的離心管中，

5. 混勻后室溫放置5分鐘，期間顛倒混勻數(shù)次。

6. 4℃ 200-2000g 離心5分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)移到一個離心管中。此上清液是去除了mRNA的總RNA。冰上放置待用。

7. 加入0.5 mL結(jié)合液，混勻后4℃ 200-2000g 離心5分鐘，小心棄上清。

8. 重復(fù)上步2-4次。

9. 加入50 uL RNA洗脫液，混勻后4℃ 200-2000g 離心5分鐘，小心收集上清（mRNA）。

10. 重復(fù)上步1-3次。

11. 將各次收集的mRNA混合。

三：用微量核酸沉淀劑沉淀mRNA

1. 按2:1的比例將微量核酸沉淀劑與mRNA溶液混合。微量核酸沉淀劑用前需要搖勻。

2. 室溫15000 g離心10分鐘（如果mRNA含量在2 ng以下，建議離心30分鐘）。

3. 小心棄上清后，加入1 mL自備的75%乙醇，振蕩混勻。

4. 15000 離心3-5分鐘，小心棄上清。

5. 再短暫離心后小心吸棄上清，沉淀即為回收的mRNA沉淀，可溶于TE或RNA洗脫液中待用。