ELISA的試劑的制備
ELISA的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物。以下敘述這些試劑的原料和制備方法。
一、固相載體
可作ELISA中載體的物質(zhì)很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來(lái)的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。在ELISA測(cè)定過(guò)程中，它作為載體和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。
ELISA載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應(yīng)板。小試管的特點(diǎn)是還能兼作反應(yīng)的容器，zui后放入分光光度計(jì)中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過(guò)程中使圓珠滾動(dòng)淋洗，效果更好。zui常用的載體為微量反應(yīng)板，于ELISA測(cè)定的產(chǎn)品也稱為ELISA板，通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測(cè)，有制成8聯(lián)或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可在特定的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果?，F(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量反應(yīng)板型的ELISA檢測(cè)，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。
良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號(hào)的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測(cè)每孔溶液的吸光度。控制反應(yīng)條件，使各讀數(shù)在0.8左右。計(jì)算所有讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10%.
二、抗原和抗體
在ELISA實(shí)施過(guò)程中，抗原和抗體的質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵因素。本法要求所用抗原純度高，抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)。
ELISA所用抗原有三個(gè)來(lái)源：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于動(dòng)物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等，一般含有多種抗原成分，需經(jīng)純化，提取出特定的抗原成分后才可應(yīng)用，因此也稱提純抗原（purifiedantigen）。重組抗原和多肽抗原均為人工合成品，使用安全，而且純度高，干擾物質(zhì)少。因此雖然制備合成抗原有較高的技術(shù)難度且要求較為昂貴的儀器設(shè)備和試劑，其應(yīng)用仍十分普遍，特別是對(duì)那些天然抗原不易得到的試驗(yàn)，更顯出其獨(dú)到之處。
三、免疫吸附劑
固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過(guò)程稱為包被（coating）。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（zui常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA板孔中在4℃過(guò)夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過(guò)低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)*覆蓋，其后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會(huì)部分地吸附于固相載體表面，zui后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過(guò)程稱為封閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時(shí)間而不失去其免疫活性醫(yī)`學(xué)教育網(wǎng)搜集整理。
四、酶和底物
ELISA中所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來(lái)源豐富、價(jià)格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定，光吸收高。ELISA中zui常用的酶為辣根過(guò)氧化酶（HRP）和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶
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