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免疫PCR試驗(yàn)方法的注意事項(xiàng)
點(diǎn)擊次數(shù)：271 發(fā)布時(shí)間：2016-12-16
免疫PCR (Immuno PCR, Im-PCR)是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的*靈敏性而建立的一種微量抗原檢測(cè)技術(shù)。是用一段已知DNA分子標(biāo)記抗體作為探針，用此探針與待測(cè)抗原反應(yīng)，PCR擴(kuò)增粘附在抗原抗體復(fù)合物上的這段DNA分子，電泳定性，根據(jù)特異性PCR產(chǎn)物的有無，來判斷待測(cè)抗原是否存在。
免疫PCR主要由兩個(gè)部分組成，*部分的免疫反應(yīng)類似于普通的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的測(cè)定過程；第二部分即通常的PCR檢測(cè)，抗原分子的量zui終由PCR產(chǎn)物的多少來反映。*步中，首先用待測(cè)抗原（如牛血清白蛋白（ESA））包被微滴板孔，再加入相應(yīng)的特異抗體，于是抗體就與固相上的抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，蛋白A-鏈親合素（Protein A-Streptavidin）嵌合體（重組融合蛋白）中的蛋白A部分可與固相上抗原抗體復(fù)合物中的抗體IgG結(jié)合，而鏈親合素部分可與*化的pUC19（質(zhì)粒DNA) (Biotin-pUC19）中的*反應(yīng)，從而將特定的DNA間接吸附于固相。接下來，就是第二步中的PCR過程，*步中吸附于固相的pUC19質(zhì)粒DNA在相應(yīng)的引物存在下，可經(jīng)PCR在幾小時(shí)內(nèi)而放大數(shù)百萬倍，PCR產(chǎn)物的多少與固相上抗原的量成正比。
其注意事項(xiàng)如下：
該實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是獲得適當(dāng)?shù)目贵w-DNA復(fù)合物。用鏈親和素將*標(biāo)記的抗體與*標(biāo)記的DNA偶聯(lián)的方法，因每個(gè)鏈親和素分子可與四個(gè)*分子結(jié)合，因此要優(yōu)化反應(yīng)條件，以使得每個(gè)鏈親和素分子既能結(jié)合上抗體分子，又能結(jié)合上DNA片段。
此外，還可用化學(xué)方法將DNA片段與抗體分子共價(jià)偶聯(lián)，即將抗體分子和5’端氨基酸修飾的DNA片段分別用不同的雙功能偶聯(lián)劑激活，然后通過自發(fā)的反應(yīng)偶聯(lián)到一起。
免疫PCR具有高敏感性。因此，抗體和標(biāo)記DNA的任何非特異性結(jié)合均可導(dǎo)致嚴(yán)重的本底問題。因而在加入抗體和標(biāo)記DNA后必須盡可能*地清洗。即使有些特異性結(jié)合的抗體或標(biāo)記DNA被洗掉了，亦可在zui后通過增加PCR的循環(huán)次數(shù)得到彌補(bǔ)。此外，應(yīng)用有效的封閉劑對(duì)防止非特異性結(jié)合也是非常重要的。可用脫脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封閉劑，用魚精DNA做核酸封閉劑。防止本底信號(hào)的另一個(gè)重要因素是控制污染，這也是所有敏感的檢測(cè)系統(tǒng)存在的問題。即使每一步試驗(yàn)都做得非常認(rèn)真，重復(fù)使用同樣的引物和標(biāo)記DNA均會(huì)產(chǎn)生假陽性信號(hào)。