研究目的

轉(zhuǎn)錄組是指在一個生物體中所有基因表達后產(chǎn)物的總和，是功能基因組研究的一個重要功能指標。基于新一代測序的動植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究可以在RNA水平研究動植物性狀、組織特異性的生理學(xué)過程，了解動植物的發(fā)育過程中的分子機制以及對外界環(huán)境的適應(yīng)和進化的機制，并為動植物疾病預(yù)防或遺傳育種的分子標記開發(fā)提供理論依據(jù)。

研究對象

動植物不同發(fā)育階段、不同物種或相同物種的不同組織器官、不同外界環(huán)境刺激或不同生理狀況的動植物的轉(zhuǎn)錄組差異檢測與分析。

新一代測序方案
lncRNA-seq（ 長非編碼RNA 測序）

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類不編碼蛋白的RNA分子，長度在200nt以上，起初被認為是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能。zui近幾年的研究表明lncRNA具有保守的二級結(jié)構(gòu)，可以與蛋白質(zhì)、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控，如染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活和抑制、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及作為miRNA的誘導(dǎo)分子干擾基因的表達等， 因此lncRNA是一片非常廣闊的未知領(lǐng)域，具有*的研究價值和意義。通過rRNA去除的方法，富集lncRNA和mRNA建庫測序，可分析lncRNA和mRNA的表達情況，并發(fā)現(xiàn)大量新lncRNA及mRNA。
*數(shù)據(jù)量：10G
polyA-seq （mRNA測序）

通過polyA尾抓取mRNA建庫測序，檢測mRNA的差異表達或結(jié)構(gòu)變異，篩選與疾病或性狀相關(guān)的分子標記。轉(zhuǎn)錄組測序可揭示轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性，確定基因以及轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)、可變剪接、RNA編輯、帶polyA尾的非編碼RNA和新轉(zhuǎn)錄本。
*數(shù)據(jù)量：5G
基因表達譜測序(升級版DGE)

采用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）建庫，直接對某一物種或特定細胞在特定功能狀態(tài)下產(chǎn)生的mRNA進行高通量測序的方法，已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、疾病機理、生物標記和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。相對而言DGE更適合用于比較基因表達，無偏性，對于細胞生物的轉(zhuǎn)錄表達譜更為敏感和準確。RNA-seq和DGE兩種方法結(jié)合，對于無參考基因組或基因組較大且復(fù)雜的物種，可以有效地發(fā)掘新的功能基因。
*數(shù)據(jù)量：10M reads
Small RNA-seq （小RNA測序）

Small RNA是生物體內(nèi)一類重要的非編碼小分子RNA，長度20-30個核苷酸，主要包含miRNA、 piRNA、siRNA、snoRNA等RNA分子。Small RNA參與基因表達與調(diào)控、RNA的加工與剪切、蛋白質(zhì)翻譯、遺傳“入侵”抑制、配子發(fā)生等生物學(xué)過程。

微小RNA(microRNA, 簡稱miRNA)，是small RNA中的主要成分, 在進化上高度保守, 可通過識別靶mRNA 實現(xiàn)

轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控。piRNA(PIWI-interacting RNA)是一類新型的非編碼小分子RNA，與PIWI蛋白相互作用，長度約26～32個核苷酸，其作用與Dicer酶無關(guān)。piRNA在生殖細胞的發(fā)育、轉(zhuǎn)座子沉默、減數(shù)分裂和精子發(fā)生等過程中具有多種生物學(xué)功能，另外piRNA還能通過調(diào)控編碼蛋白基因的甲基化修飾影響神經(jīng)細胞的記憶功能。如果piRNA研究趨勢與microRNAs相似的話，那么可以預(yù)見piRNA無疑將一輪新的研究熱潮。
*數(shù)據(jù)量：10M reads

案例解讀

轉(zhuǎn)錄組測序研究胚胎發(fā)育過程lncRNA的作用(Andrea Pauli et al., Genome Research. 2012)

背景：lncRNA是指長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。lncRNA能夠與修飾組蛋白的蛋白復(fù)合體相互作用并影響其活性，從而控制基因的活化狀態(tài)（可激活、激活或抑制），是胚胎發(fā)育過程*的調(diào)節(jié)子。本文系統(tǒng)報道了脊椎動物胚胎的lncRNA表達圖譜，為以后的遺傳學(xué)、基因組學(xué)和進化研究提供了基礎(chǔ)。

選材：研究者以野生型斑馬魚胚胎為研究對象，在受精后的不同時期（0.75h、3h、4.5h、6h、10h、28h、48h和120h）分別收集1000個胚胎（見圖2），為了消除差異，樣品在10分鐘之內(nèi)完成收集。

    選材：研究者以野生型斑馬魚胚胎為研究對象，在受精后的不同時期（0.75h、3h、4.5h、6h、10h、28h、48h和120h）分別收集1000個胚胎（見圖2），為了消除差異，樣品在10分鐘之內(nèi)完成收集。測序方法：采用polyA尾富集的方法進行RNA測序，平均測序數(shù)據(jù)量為200-300M reads，鑒定了胚胎發(fā)育過程中相關(guān)的lncRNA和mRNA。

結(jié)果：獲得斑馬魚不同發(fā)育時間點的lncRNA表達圖譜

1. 斑馬魚不同時間點的發(fā)育圖譜

圖2. 斑馬魚發(fā)育取樣時期。

2. 斑馬魚lncRNA功能分析

對鑒定的835個lncRNA基因座和mRNA進行共表達分析，共表達結(jié)果進行GO分析，zui重要的10個GO中，主要與信號通路（簇2）、發(fā)育（簇6）和細胞周期（簇8）相關(guān)，簇4-7幾乎都與發(fā)育功能相關(guān)，說明胚胎中的lncRNA可能發(fā)揮發(fā)育調(diào)控的作用，見圖3。對幾個重要的lncRNA進行原位雜交驗證，發(fā)現(xiàn)不同的lncRNA在不同的發(fā)育時期的表達情況，在二細胞期、肌肉和神經(jīng)組織中都有特異性表達，見圖4。

圖3. lncRNA與mRNA共表達分析，行表示lncRNA，列表是功能基因，紅色表示正相關(guān)，藍色表示負相關(guān)，白色表示不相關(guān)。

圖4. lncRNA組織特異性原位雜交，對GO分析中重要的lncRNA進行原位雜交，顯示相應(yīng)lncRNA在二細胞期、肌肉和神經(jīng)組織的特異性表達。