*ELISA快速檢測(cè)試劑盒使用說明書
一、檢測(cè)原理
本試劑盒是利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔上預(yù)包被抗*抗原。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，*抗體及酶標(biāo)記物，包被抗原和加入樣本中的*藥物競(jìng)爭(zhēng)性地與*抗體結(jié)合后，再與酶標(biāo)記物形成抗原抗體復(fù)合物，用TMB底物顯色；加入反應(yīng)終止液，在450nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀下進(jìn)行檢測(cè)，樣品中的*濃度與吸收光強(qiáng)度成反比。
二、檢測(cè)范圍
本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的藥物殘留檢測(cè)產(chǎn)品,與儀器分析技術(shù)比較，能經(jīng)濟(jì)、快速地檢測(cè)出畜禽組織、蜂蜜、牛奶中的*
規(guī) 格：96孔/盒
靈 敏 度： 0.1ppb
檢測(cè)時(shí)間：75min
樣本檢測(cè)下限：
畜禽組 織（雞、鴨、豬肉等）…………………… 2ppb
蜂蜜、牛奶………………………………………… 2ppb
樣本回收率
畜禽組 織（雞、鴨、豬肉等）……………80% ±10%
蜂蜜、牛奶…………………………………85% ±10%
交叉反應(yīng)率
*…………………………100%
四、*ELISA快速檢測(cè)試劑盒組成
- 微量測(cè)試孔：1×96孔板（12條×8孔）
- 標(biāo)準(zhǔn)溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
- 高濃度標(biāo)準(zhǔn)液×1瓶：（1ml/瓶）100 ppb
- 酶標(biāo)記物 7ml………………………紅色帽
- 200×濃縮受體 100ul…………………離心管
- 受體稀釋液 10ml ……………………綠色帽
- 抗體工作液 7ml ………………………紅色帽
- 底物A液 7ml ………………………棕色帽
- 底物B液 7ml …………………… 黑色帽
- 終 止 液 7ml …………………… 黃色帽
- 20×濃縮洗滌液40 ml ……………… 白色帽
- 2× 濃縮復(fù)溶液 50ml ·……………… 藍(lán)色帽
- 說明書 ……………………………………1份
五、【所用儀器、試劑】
儀器：微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g ）
微量移液器：?jiǎn)蔚?20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl
試 劑：Na2HPO4·12H2O、 NaH2PO4·2H2O、NaCl
六、【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】
配液1、0.02M PBS緩沖液 5.16gNa2HPO4*12H2O+0.87gNaH2PO4*2H2O
+8.5gNaCl，加入蒸餾水至1000ml）用于樣品提取。
配液2、1×復(fù)溶工作液
將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：1稀釋。(1份濃縮復(fù)溶+1
份去離子水，用于樣本提取后的稀釋)。
配液3、洗滌液
將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
配液4 、受體工作液的配制：
取5ul的200X濃縮受體，加入1000ul 受體稀釋液混
勻即可，或按所需用量配制抗體。
七、【*ELISA快速檢測(cè)試劑盒樣本前處理步驟】
處理任何樣本時(shí)，都必須注意：
（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。
（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
(a)組織/蜂蜜樣本前處理方法
- 取2±0.05g樣本與4ml 0.02MPBS緩沖液混合震蕩5min，靜置10min；3000g以上，室溫離心10min；
- 取50ul上清液，加入450ul 稀釋后的復(fù)溶液混勻，混合30s；
- 取50ul用于分析。
- 樣本稀釋倍數(shù)：20
（b）牛奶
- 取1ml牛奶樣本于離心管中，在3000r/min，4℃離心10min，去除上層脂肪。
- 取50ul上清液，加入950ul 稀釋后的復(fù)溶液混勻，混合30s
- 取50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：20倍
八、酶聯(lián)免疫檢測(cè)步驟
- 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
- 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
- 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
- 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加配制好的受體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
- 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
- 加入抗體工作液50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
- 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
- 顯色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
- 測(cè)定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。
九、結(jié)果分析
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含*成負(fù)相關(guān)
1、粗略判定
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.510；0.1ppb為1.320；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.660； 2.7ppb為0.389；8.1ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中*G實(shí)際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即：百分吸光度值（%）＝B/B0 ×100%
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以*濃度（ng /ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中*實(shí)際含量。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索取）
- 標(biāo)準(zhǔn)曲線
B/B0 (%)
*(ppb) [µg/kg]
圖1：*檢測(cè)試劑盒的回歸曲線
4、再現(xiàn)性
%CV
*(ppb) [µg/kg]
圖2：*檢測(cè)試劑盒的精密度
由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出*檢測(cè)試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對(duì)相應(yīng)*濃度作曲線，可以看到全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。
十、注意事項(xiàng)
- 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
- 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
- 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
- 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
- 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。
- 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
- 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
- 該試劑盒反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【儲(chǔ)存】
原包裝應(yīng)儲(chǔ)存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。
【有效期】
有效期12個(gè)月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號(hào)見外包裝。
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