人胸膜瘤細(xì)胞操作前打開(kāi)紫外燈30-60分鐘，這個(gè)大家都知道。不過(guò)你別忘了還要在操作前至少10分鐘打開(kāi)抽濾裝置來(lái)保證效果，但紫外消毒期間建議不要進(jìn)去一次特意打開(kāi)抽濾裝置，可以與紫外燈一起打開(kāi)，人胸膜瘤細(xì)胞此時(shí)不需要抽濾開(kāi)的過(guò)大就可以。（所謂的抽濾裝置就是就是那個(gè)風(fēng)機(jī)，就是吹風(fēng)超凈工作臺(tái)，不是過(guò)濾培養(yǎng)液的）!

細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法）具體操作：

一：傳代前準(zhǔn)備；

1.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。

2.用75％酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。

3.正確擺放使用的器械：保證足夠的*作空間，不僅便于*作而且可減少污染。

4.點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。

5.準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。

6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：人胸膜瘤細(xì)胞取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。

7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。

8.打開(kāi)瓶口：將各瓶口一一打開(kāi)，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。

二：胰蛋白酶消化；

1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞，*消化溫度是37℃。

2. 人胸膜瘤細(xì)胞 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。

3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。

三：吹打分散細(xì)胞；

1.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。

2.吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。

3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。

4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。

四：分裝稀釋細(xì)胞；

1.分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過(guò)小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。zui后要做好標(biāo)記。

五：繼續(xù)培養(yǎng)；

用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。人胸膜瘤細(xì)胞傳代細(xì)胞2小時(shí)后開(kāi)始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時(shí)為一個(gè)＋，占50％為＋＋，占75％時(shí)為＋＋＋。  

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