深入剖析！如何利用CRISPR技術(shù)編輯人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞？

過去10年里誕生了兩種非常有用的生物學(xué)工具，*個就是人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs），這是一項榮獲諾貝爾獎的*科技產(chǎn)物，2006年時研究者開始對小鼠進(jìn)行實驗，隨后在人類機(jī)體中進(jìn)行實驗，研究者表示他們有可能將成體的皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為多能干細(xì)胞，隨后這些多能干細(xì)胞就能夠被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化成為任何類型的細(xì)胞，這些細(xì)胞是個體基因組在細(xì)胞尺度的化身，而且其可以幫助科學(xué)家開發(fā)出那些不能取自活體的細(xì)胞類型，ipsCs通常能夠提供方法來模仿單成因及復(fù)雜的人類疾病，同時還可以指導(dǎo)進(jìn)行基于細(xì)胞的療法。
第二項工具就是CRISPR-Cas9系統(tǒng)，其能夠?qū)蚪M中的任何區(qū)域進(jìn)行準(zhǔn)確的編輯，當(dāng)涉及傳統(tǒng)永生的細(xì)胞系，比如HeLa或HEK293細(xì)胞系時，利用CRISPR進(jìn)行切割或許會作為一個新手讓研究者學(xué)習(xí)數(shù)周，第二波基于CRISPR的方法常常是通過增強(qiáng)或者減弱基因表達(dá)的水平來發(fā)揮作用的，而不是進(jìn)行基因的切割，這或許可以使得這種方法變得更加有用。
上述兩種技術(shù)的結(jié)合或?qū)聿豢晒懒康男?yīng)，利用CRISPR編輯的iPSCs可以使得科學(xué)家對基因進(jìn)行操作來研究在特殊疾病背景下的基因功能，或者去糾正病人細(xì)胞中的遺傳缺陷，而其中一種挑戰(zhàn)就是幫助定位的無縫基因編輯技術(shù)或許就能夠確定不同ipsC細(xì)胞系的遺傳變異，CRISPR-Cas9技術(shù)就能夠幫助科學(xué)家制造出新型的僅通過單個核苷酸改變且用作特殊個體的質(zhì)控細(xì)胞。
盡管CRISPR-Cas9和人類iPSCs已經(jīng)成為研究者在實驗室中老生常談的話題了，但對兩者進(jìn)行統(tǒng)一卻并不容易，想要研究基因功能的科學(xué)家如今正在發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中很難維持人類ipsCs，而且也很難利用CRISPR進(jìn)行操作。
zui基本的工作流程
編輯且控制人類iPSCs細(xì)胞中的基因表達(dá)往往以兩條平行的工作流開始，首先就是保證多能細(xì)胞的可靠來源，其次就是設(shè)計導(dǎo)向RNA，即可以靶向作用基因且具有20個核苷酸的序列。為了利用導(dǎo)向RNA和Cas9核酸酶來轉(zhuǎn)染細(xì)胞，電穿孔技術(shù)就是主要的方法，因為其能夠幫助科學(xué)家在維持細(xì)胞活性的同時將大量的DNA及蛋白質(zhì)輸入到細(xì)胞中，由于人類多能干細(xì)胞在運(yùn)輸過程中會沉默基因的表達(dá)，因此就應(yīng)當(dāng)盡可能地避免慢病毒運(yùn)輸。研究者通過追蹤細(xì)胞的形態(tài)、多潛能標(biāo)志以及細(xì)胞分化的能力來評估細(xì)胞的多能性，核型分析技術(shù)通常就能夠確保細(xì)胞中有著正常數(shù)量的染色體，而且ipsC細(xì)胞系可以被用來廣泛購買。
人類多能干細(xì)胞VS人類腫瘤細(xì)胞系
首先研究者在人類癌細(xì)胞系中嘗試CRISPR-Cas9工具，當(dāng)他們準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移到研究人類多能干細(xì)胞時，他們發(fā)現(xiàn)人類的iPSCs屬于勞動密集型分布，而且難以維持。來自哈佛醫(yī)學(xué)院的研究者Susan Byrne說道，有經(jīng)驗的研究者常常會花費(fèi)一個月時間來學(xué)習(xí)人類iPSC的基本培養(yǎng)技術(shù)，即使那樣，由于新步驟和試劑的出現(xiàn)，利用這些細(xì)胞進(jìn)行研究仍然是一個需要持續(xù)學(xué)習(xí)的過程。干細(xì)胞非常特殊，其質(zhì)量影響著我們培養(yǎng)細(xì)胞以及利用導(dǎo)向RNAs靶向作用細(xì)胞的能力，而我們看到的改變依賴于單一的供體及重編程的方法，有時候我們不得不優(yōu)化制造特殊干細(xì)胞系的步驟。來自霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究者Linzhao Cheng說道，在一般情況下，甚至利用健康細(xì)胞系時，我們應(yīng)當(dāng)期望降低10倍效率來將對人類ipsCs和ESCs進(jìn)行編輯。
開始了解我們的基因
研究者表示，我們應(yīng)當(dāng)研究基因位點(diǎn)并且理解這些序列的功能，比如，在基因編輯之后被干擾的基因仍然會表現(xiàn)出某些生物活性，在某些情況下我們應(yīng)當(dāng)考慮基因位點(diǎn)發(fā)生了雙重切割，而這目的是為了切除更大的基因區(qū)域。
選擇多種導(dǎo)向RNAs并且對其進(jìn)行檢測，如今大量的軟件都能夠選擇導(dǎo)向RNAs，但我們要記住，特殊的導(dǎo)向RNA似乎并不能很好地進(jìn)行工作，或者根本不會工作；來源于事實的一個非常簡單且zui容易被忽視的原因就是根據(jù)我們的向?qū)гO(shè)計我們或許并沒有相關(guān)的基因組，此外我們也應(yīng)當(dāng)需要考慮向?qū)У幕钚浴?br />敲除VS編輯
當(dāng)利用CRISPR-Cas9切割基因時，兩個主要的分子途徑就會開啟來進(jìn)行DNA修復(fù)，而且zui終會確定隨后編輯作用的保真性，這兩個修復(fù)通路同時會發(fā)生，用作基因敲除的非同源性末端接合（NHEJ）能夠在DNA中產(chǎn)生小型的插入位點(diǎn)或剔除位點(diǎn)來阻斷基因的功能；另外一種名為同源性直接修復(fù)（HDR）的作用則會基于供體的長鏈DNA來產(chǎn)生的核苷酸改變。
目前研究者Hockemeyer及其同事正在開發(fā)新型策略來使得同源性直接修復(fù)發(fā)揮主要作用，比如應(yīng)用特殊的化學(xué)物或利用來自不同物種的Cas9酶等，研究者說道，我認(rèn)為在未來幾年里我們解決這些問題指日可待。
研究者Conklin的團(tuán)隊開發(fā)出了一種快速的數(shù)字PCR技術(shù)，其能夠?qū)DR和NHEJ的修復(fù)率進(jìn)行定量，在包括人類ipsCs的多個細(xì)胞類型中，上述兩種修復(fù)率并沒有互相關(guān)聯(lián)，這就表明，相比單單測定一種修復(fù)率而言，同時測定兩種修復(fù)率是非常明智的，尤其是當(dāng)目標(biāo)是HDR的時候。
對切割進(jìn)行特性描述
在細(xì)胞分化前和分化后，測定或者掌握細(xì)胞的表型，比如形狀或特殊標(biāo)志物的存在，都是我們證實是否在合適位置切割的zui基本的方法，利用和待編輯基因互補(bǔ)的DNA來補(bǔ)充編輯的細(xì)胞或許能夠恢復(fù)細(xì)胞的表型，如果細(xì)胞表型太精細(xì)不能測出微小改變的話，研究者或許就應(yīng)當(dāng)嘗試對基因進(jìn)行第二次編輯來將其恢復(fù)至野生型。
此外研究者還抽取了基因編輯的基因組進(jìn)行調(diào)查，比如利用這些區(qū)域的PCR和Sanger測序結(jié)果等，一種名為TIDE的算法可以重建預(yù)期突變的身份，同時還能夠揭示其發(fā)生的機(jī)制。研究者M(jìn)ali說道，對所有的蛋白編碼基因和外顯子組進(jìn)行測序或許就能夠幫助挑選已經(jīng)驗證的編輯，測序是當(dāng)前的主要分析方法；從另一方面來講，隨著時間遺傳差異性會不斷積累，而這與細(xì)胞系并無關(guān)聯(lián)。
脫靶效應(yīng)
一種抑制脫靶編輯的主要方法就是至少利用兩種或多種靶向作用相同位點(diǎn)的不同“向?qū)?rdquo;，而這或許并不可能給出相同的脫靶結(jié)果；一般而言，脫靶效應(yīng)并不是主要的問題所在，至少對于大多數(shù)基礎(chǔ)科學(xué)家而言是這樣的，相比癌細(xì)胞系而言，脫靶效應(yīng)往往并不太可能發(fā)生于人類的多能干細(xì)胞中，但研究者如果真得非常關(guān)心的話，進(jìn)行全外顯子組測序或許就是的方法了。
控制基因的表達(dá)而不是對基因進(jìn)行編輯
如果希望對多能干細(xì)胞中對多能性表現(xiàn)非常重要的基因進(jìn)行敲除的話，很明顯我們的運(yùn)氣并不夠好，我們或許并不能用死細(xì)胞得出太多信息，在這種情況下，我們就需要提高或減弱基因的表達(dá)，而擴(kuò)大CRISPR-Cas9工具的功能或許就能達(dá)到這種目的；研究者們通常會使用一種“死亡版本”的Cas9，其能夠結(jié)合到基因組中的預(yù)定位置但并不會切割DNA序列，相反，死亡版本”Cas9的不同突變體要么會抑制轉(zhuǎn)錄（稱之為CRISPR干擾，CRISPRi），要么會激活表達(dá)。
近來一項研究發(fā)現(xiàn)，對ipsCs篩查尋找功能缺失區(qū)域時，相比CRISPR-Cas9而言，CRISPRi或許會比傳統(tǒng)的CRISPR更加有效，CRISPRi能夠沉默95%的細(xì)胞中的基因表達(dá)，而CRISPR-Cas9僅能夠沉默60%至70%細(xì)胞中基因的表達(dá)，這是因為CRISPR-Cas9并不總是會引發(fā)移碼突變，而移碼突變通常會使得蛋白質(zhì)部分或*失去功能，也就是說，成功地沉默基因的表達(dá)往往因細(xì)胞類型和位點(diǎn)不同而不同。
基因表達(dá)控制和基因編輯之間的主要差異就是，在基因表達(dá)控制下，我們或許并不能*地改變基因組，我們可以擾亂細(xì)胞的功能，比如沉默基因表達(dá)隨后逆轉(zhuǎn)基因的抑制作用；此外，相比CRISPR-Cas9而言，脫靶效應(yīng)或許更少地同CRISPRi和CRISPRa（CRISPR激活）相關(guān)。調(diào)節(jié)基因表達(dá)面臨的一個挑戰(zhàn)就是研究者很難選擇或設(shè)計一套堅實的導(dǎo)向RNAs，研究者表示，在理想狀況下他們可以避免基因組的區(qū)域被核小體緊密圍繞，而蛋白的纏繞往往會使得基因沉默，但在某些情況下，這些區(qū)域就很有可能是研究者所要靶向作用的區(qū)域。
對于研究者而言，將CRISPRi和CRISPRa有效成功地運(yùn)輸?shù)饺祟惗嗄芨杉?xì)胞中非常復(fù)雜，研究者Cowen指出，目前除非使用病毒載體的運(yùn)輸方法，否則仍然很難將CRISPRi和CRISPRa運(yùn)輸?shù)?0%至80%的細(xì)胞中，而目前我們僅僅談?wù)摰氖?0%至40%的細(xì)胞，研究者認(rèn)為這或許能給他們帶來一定幫助，因為在某些情況下他們很難或者不可能將ipsC分化成為特殊類型的細(xì)胞，研究者Cowen長期利用CRISPRa來激活并且驗證報道基因，他表示，在我們實驗室利用腎臟內(nèi)皮細(xì)胞就能夠知道報道基因是否在正常工作。