質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)方法

一、導(dǎo)論 
  　　已經(jīng)提出過許多方法用于從細(xì)菌中提純質(zhì)粒DNA， 這些方法都含有以下3個步驟： 
細(xì)菌培養(yǎng)物的生長。 
細(xì)菌的收獲和裂解 
質(zhì)粒DNA的純化。  
 
（一）細(xì)菌培養(yǎng)物的生長  
從瓊脂平板上挑取一個單菌落，接種到培養(yǎng)物中(有含有行當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中生長)，然后從中純化質(zhì)粒，質(zhì)粒的提純幾乎總是如此?，F(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體（如pUC系列）都能復(fù)制到很高的拷貝數(shù)，惟致只要將培養(yǎng)物放在標(biāo)準(zhǔn)LB 培養(yǎng)基中生長到對數(shù)晚期，就可以大量提純質(zhì)粒。此時，不必造反性地?cái)U(kuò)增質(zhì)粒DNA。然而，較長一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復(fù)制，所以需要在得到部分生長的細(xì)菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時，以便對質(zhì)粒進(jìn)行性擴(kuò)增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成，結(jié)果阻止了細(xì)菌染色體的復(fù)制，然而，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，在若干小時內(nèi)，其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。這樣，像pBR３２２－類的質(zhì)粒，從經(jīng)氯霉素處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同，前者大為增高。多年來，加入足以*抑制蛋白質(zhì)合成的氯霉素μg/ml)已成為標(biāo)準(zhǔn)的操作、用該方法提取的質(zhì)粒DNA量，對于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務(wù)。 
 
（二）細(xì)菌的收獲和裂解 
細(xì)菌的收獲可通過離心來進(jìn)行，而細(xì)菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于３個因素：質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。 盡管針對質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出的裂解條件不切實(shí)際，但仍可據(jù)下述一般準(zhǔn)則來選擇適當(dāng)方法，以取得滿意的結(jié)果。 
1)大質(zhì)粒(大于15kb)容易受損，故應(yīng)采用漫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來。將細(xì)菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進(jìn)生處理，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，再加入SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法zui大限度地減小了從具有正壓的細(xì)菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來所需要的作用力。 
2)可用更劇烈的方法來分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后，有時還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌暴露于去污劑，通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成*天然的超螺旋分子。 
3)一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類，當(dāng)隨后用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時它們會惹出麻煩。糖類會在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時，不宜使用煮沸法。 
4)當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制備質(zhì)粒時，建議不使用煮沸法。因?yàn)橹蠓胁荒?滅活內(nèi)切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時，質(zhì)粒DNA會被降解。但如果通過一個附加步驟(用酚：進(jìn)行抽提)可以避免此問題。 
５)目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不需要用氯霉素進(jìn)行選擇性擴(kuò)增就可獲得高產(chǎn)。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，而是要降低細(xì)菌細(xì)胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細(xì)菌裂解物，處理起來煞為費(fèi)事，而在對數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉素存在時從較少量細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加氯霉素時從較大量細(xì)胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。 
 
(三)質(zhì)粒DNA的純化  
常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對較小及共價閉合環(huán)狀這樣兩個性質(zhì)。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。zui后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多的染料，直至達(dá)到飽和( 每２個堿基對大約結(jié)合１個溴化乙錠分子) 。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的方法。然而該過程既昂貴又費(fèi)時，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。本實(shí)驗(yàn)室采用離子交換層析法已可得到*純度的質(zhì)粒。另外，現(xiàn)在已可買到現(xiàn)成的純化KIT。 
 
二、質(zhì)粒DNA的小量制備 
細(xì)菌的收獲和裂解 
收獲 
堿裂解法 
煮沸裂解 
質(zhì)粒ＤＮＡ小量制備的問題與對策  
質(zhì)粒ＤＮＡ的小量制備可采用下述的堿裂解法或煮沸法 
 
（一）細(xì)菌的收獲和裂解 
１．收獲 
１）將2ml含相應(yīng)抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。 
２）將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。 
３）吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離細(xì)菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。 
 
２．堿裂解法 
１）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ｉ中，劇烈振蕩。 
溶液Ｉ 
50mmol/L葡萄糖 
25mmol/L Tris．Cl(pH8.0) 
10mmol/LEDTA(pH8.0) 
溶液Ｉ可成批配制，每瓶約100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。須確使細(xì)菌沉淀在溶液Ｉ中*分散，將兩個微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。 
２）加200μl新配制的溶液Ⅱ。 
溶液Ⅱ 
0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋） 
1%SDS 
蓋緊管口，快速顛倒離心管５次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個內(nèi)表面 
均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。 
３）加150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ  
溶液Ⅲ 
5mol/Ｌ乙酸鉀 60ml 
冰乙酸 11.5ml 
水 28.5ml 
所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。 
蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后 
將管置于冰上３－５分鐘。 
４）用微量離心機(jī)于4℃12 000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。 
５）可做可不做：加等量酚：氯念， 振蕩混勻， 用微量離心機(jī)于4 ℃以12000g離心 
２分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。有些工作者認(rèn)為不*酚：進(jìn)行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會得到可耐受限制酶切反應(yīng)的DNA。 
６）用２倍休積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合， 于室溫放置２分鐘。 
７）用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心５分鐘。 
８）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時，盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。 
９）用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8）所術(shù)方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。 
i.此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒（如Ｘf3或pUC），其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌培養(yǎng)物3－5μg。 
ii．如果要通過限制酶切割反應(yīng)來分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含８μl水的微量離心管內(nèi)，加1μl 10×限制酶緩沖液和１單位所需限制酶， 在適宜溫育1－2小時。將剩余的DNA貯存于－20℃。 
iii.此方法按適當(dāng)比例放大可適用于100ml細(xì)菌培養(yǎng)物 
 
３．煮沸裂解 
１）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于350μlSTET中。 
STET 
0.1mol/L NaCL 
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 
1mmol/L EDTA(pH8.0) 
5% Triton X-100 
２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮作用。 
３）將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為40秒。 
４）用微量離心機(jī)于室溫以12 000g離心10分種。 
５）用無菌牙簽從微量離心管中去除細(xì)菌碎片。 
６）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。 
７）用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。 
８）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴。 
９）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g離心２分鐘。 
10）按步驟8）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因?yàn)橛袝r沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無可見的液體（2－5）分鐘。 
11）用50μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。 
注：當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶Ａ的大腸桿菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA時，建議舍棄煮沸法。因?yàn)橹蠓胁襟E不能*滅活內(nèi)切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下溫育（V中用限制酶時）質(zhì)粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟９）之間增加一步，即用酚：進(jìn)行抽提，可以避免這一問題。 
 
（二）質(zhì)粒ＤＮＡ小量制備的問題與對策  
裂解和煮佛法都極其可靠，重復(fù)性也很好，而且一般沒有會么麻煩。多年來，在我們實(shí)驗(yàn)室日常使用這兩種方法的過程中，只碰到過兩個問題： 
１）有些工作者進(jìn)行小量制備時，有時會發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：對溶液進(jìn)行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA。 
２）在十分偶然的情況下，個別小時制備物會出現(xiàn)無質(zhì)粒DNA的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。  
 
三、質(zhì)粒ＤＮＡ的大量制備 
在豐富培養(yǎng)基中擴(kuò)增質(zhì)粒 
細(xì)菌的收獲和裂解 
收獲 
堿裂解法 
 
（一）在豐富培養(yǎng)基中擴(kuò)增質(zhì)粒 
許多年來，一直認(rèn)為在氯霉素存在下擴(kuò)增質(zhì)粒只對生長在基本培養(yǎng)基上的細(xì)菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl復(fù)制子的高拷貝數(shù)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產(chǎn)量至每500ml培養(yǎng)物2－5mg質(zhì)粒DNA，而且重復(fù)性也很好。 
１）將30ml含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對數(shù)晚期（DNA 600約0.6)。培養(yǎng)基中應(yīng)含有相應(yīng)抗生素，用單菌落或從單菌落中生長起來的小量液體閉關(guān)物進(jìn)行接種。 
２）將含相應(yīng)抗生素的500ml ＬＢ或Terrific肉湯培養(yǎng)基（預(yù)加溫至37℃）施放入25ml對數(shù)晚期的培養(yǎng)物，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時（搖床轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分），所得培養(yǎng)物的OD 600值約為0.4。 
３）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使終濃度為170μg/ml。像pBR322一類在宿主菌內(nèi)只以中等拷貝婁竿行復(fù)的質(zhì)粒，有必要通過擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長達(dá)到餉新一代的質(zhì)粒（如pUC質(zhì)粒）可復(fù)制達(dá)到很高的拷貝數(shù)，因此無需擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長達(dá)到飽和的細(xì)菌培養(yǎng)物即可大量提純。但用氯霉素進(jìn)行處理，具有抑制細(xì)菌復(fù)制的優(yōu)點(diǎn)，可減少細(xì)菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡化質(zhì)粒純化的過程。所以一般說來，盡管要在生長中的細(xì)菌培養(yǎng)物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊。 
４）于37℃劇烈振搖（300轉(zhuǎn)/分），繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時。 
 
（二）細(xì)菌的收獲和裂解 
１．收獲 
１）用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。 
２）將細(xì)菌沉淀重懸于100ml用冰預(yù)冷的STE中。 
STE 
0.1mol/L NaCl 
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 
1mmol/L EDTA(pH8.0) 
２）按步驟１）所述方法離心，以收集細(xì)菌細(xì)胞。 
２，堿裂解法 
 
１）將冼過的500ml 培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀物[ 來自收獲細(xì)菌的步驟3] 重懸于10ml（18ml）溶液Ｉ中。 
溶液Ｉ 
50mmol/L葡萄糖 
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 
10mmol/L EDTA(pH8.0) 
溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于４℃。 
２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。當(dāng)溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。 
３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。 
溶液Ⅱ 
0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋） 
1％SDS 
蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物。于室溫放置5-10分鐘。 
４）加15nl(20ml)用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ。 
溶液Ⅲ 
5mol/L乙酸鉀 60ml 
冰乙酸 11.5ml 
水 28.5ml 
所配成的溶液對鉀是３mol/L，對乙酸根是5mol/L。 
封住瓶口，搖動離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，此時應(yīng)不再出現(xiàn)分明的兩個液相。置冰上放10分鐘，應(yīng)形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應(yīng)包括染體DNA、 高分子量RNA和鉀－SDS－蛋白質(zhì)－膜復(fù)合物。 
５）用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，不開剎車而使轉(zhuǎn)頭自然停轉(zhuǎn)。如果細(xì)菌碎片貼壁不緊，可以5000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細(xì)菌裂解物混合不充分[步驟４）]。 
６）上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。 
７）用合適轉(zhuǎn)頭于室溫以500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會了生沉淀。 
８）小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使zui后殘余的痕量乙醇揮殆盡。 
９）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。 
10）純化。 
四、質(zhì)粒ＤＮＡ的純化 
聚乙二醇沉淀法質(zhì)粒ＤＮＡ 
氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)ＤＮＡ 
  
（一）聚乙二醇沉淀法提取質(zhì)粒ＤＮＡ 
１）將核酸溶液所得]轉(zhuǎn)入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉(zhuǎn)頭于４℃下以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。 
２）將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇， 充分混勻， 用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖）于室溫以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分釧， 回收沉淀的核酸。 
３）小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使zui后殘留的液滴流盡。于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使zui后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。 
４）用500μl含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。 
５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量離心機(jī)于４℃以12000g離心５分鐘，以回收質(zhì)粒ＤＮＡ。 
６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA沉淀。用酚、酚：各抽１次。 
７）將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中，加100μl 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加２倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12 000g離心5分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒ＤＮＡ。 
８）吸去上清，加200μl處于4℃以12 000g離心2分鐘。 
９）吸去上清，敞開管口，將管置于實(shí)驗(yàn)桌上直到zui后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。 
10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋[用TE（pH8.0)] 后測量OD 260，計(jì)算質(zhì)粒DNA的濃度（1OD260＝50μg質(zhì)粒DNA/ml）， 然后將DNA貯于－20℃。 
  
（二）氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)ＤＮＡ 
此方法可獲的較高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，但耗時且費(fèi)用昂貴目前較少采用，這里不多綴述。