擬南芥原生質(zhì)體制備轉(zhuǎn)化方法

實(shí)驗(yàn)試劑

1. 纖維素酶解液：

2. PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是現(xiàn)用現(xiàn)配，每個(gè)樣品需100μl PEG4000溶液，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣品量調(diào)整溶液配置總量）

3. W5 溶液

4. MMG溶液

5. WI溶液

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 土培室播種種植擬南芥。

2. 生長(zhǎng)良好情況下在未開(kāi)花前用于取材葉片制備原生質(zhì)體。

3. 剪取中部生長(zhǎng)良好的葉片用刀片切成0.5 -1 mm寬的葉條。

4. 將切好葉條擲入預(yù)先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大約需10-20片葉子）。并用鑷子幫助使葉子*浸入酶解液。

5. 用真空泵于黑暗中抽30分鐘。（此時(shí)可配制PEG4000溶液，200和1000 ul槍頭去尖使操作時(shí)吸打緩和。）

6. 在室溫中無(wú)須搖動(dòng)繼續(xù)黑暗條件下酶解至少3個(gè)小時(shí)。當(dāng)酶解液變綠時(shí)輕輕搖晃培養(yǎng)皿促使原生質(zhì)體釋放出來(lái)。（此時(shí)預(yù)冷一定量W5溶液）

7. 顯微鏡下檢查溶液中的原生質(zhì)體，擬南芥葉肉原生質(zhì)體大小大約30-50 um。

8. 在過(guò)濾除去未溶解的葉片前用等量的W5溶液稀釋含有原生質(zhì)體的酶液。

9. 先用W5溶液潤(rùn)濕35-75 um的尼龍膜或60-100目篩子，然后用它過(guò)濾含有原生質(zhì)體的酶解液。

10. 用30毫升的圓底離心管100g，1-2分鐘離心沉淀原生質(zhì)體。盡量去除上清然后用10ml 冰上預(yù)冷的W5溶液輕柔重懸原生質(zhì)體。

11. 在冰上靜至原生質(zhì)體30分鐘。

以下操作在室溫23℃下進(jìn)行

12. 100g離心八至十分鐘使原生質(zhì)體沉淀在管底。在不碰觸原生質(zhì)體沉淀的情況下盡量去除W5溶液。然后用適量MMG溶液（1m）重懸原生質(zhì)體，使之zui終濃度在2X10⁵個(gè)/ml。

13. 加入10 ul DNA（10-20微克約5-10kb的質(zhì)粒DNA）至2ml離心管中。

14. 加入100 ul原生質(zhì)體（2x10⁴個(gè)），輕柔混合。

15. 加入110 ul PEG溶液，輕柔拍打離心管*混合（每次大約可以轉(zhuǎn)化6-10個(gè)樣品）。

16. 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化混合物5-15分鐘（轉(zhuǎn)化時(shí)間視實(shí)驗(yàn)情況而定，要表達(dá)量更高也許需要更高轉(zhuǎn)化時(shí)間）。

17. 室溫下用400-440 ul W5溶液稀釋轉(zhuǎn)化混合液，然后輕柔顛倒搖動(dòng)離心管使之混合完好以終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

18. 室溫下用臺(tái)式離心機(jī)100g離心2分鐘然后去除上清。再加入1ml W5溶液懸浮清洗一次，100g離心兩分鐘去上清。

19. 用1ml WI溶液輕柔重懸原生質(zhì)體于多孔組織培養(yǎng)皿中。

20. 室溫下（20-25℃）誘導(dǎo)原生質(zhì)體18小時(shí)以上。

21. 激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP標(biāo)簽表達(dá)。

（以上實(shí)驗(yàn)可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)情況適當(dāng)調(diào)整）