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                  Interleukin 6（IL-6）
       Interleukin 6（IL-6） mRNA原位雜交試劑盒
 
產(chǎn)品編號(hào)：QY-10045
保存：置４℃。
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：人、大鼠 。
試劑盒中內(nèi)容
    1.Interleukin 6（IL-6）   寡核苷酸探針雜交液       2ml；
  2.預(yù)雜交液                     2ml；
  3.胃蛋白酶（×10;Pepsin）      2ml；
  4.封閉液                       5ml；
  5.化鼠抗地高xin          5ml；
  6.SABC-POD                     5ml；
  7.化過(guò)氧化物酶           5ml。
用戶(hù)自備試劑：原位雜交蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液（3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC， 原位雜交用PBS ）
一．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片
準(zhǔn)備工作：
固定液： 4% 多聚甲醛 /0.1 M PBS （PH7.2-7.6 ）； 1% 多聚甲醛 /0.1 M
PBS （ PH7.2-7.6 ） 3% 檸 檬 酸 — — 100ml 蒸 餾 水 中 加 檸 檬 酸
（C6H8O7·H2O）3g,PH2.0左右。2×SSC——1000ml 蒸餾水中加氯化鈉17.6g，
檸檬酸三鈉（C6H5O7Na3·2H2O，分子量294）8.8g。 0.5×SSC——300ml 蒸餾水
加100ml 2×SSC 即可。0.2×SSC——270ml 蒸餾水加30ml 2×SSC 即可。20%甘油
——20ml 甘油加 80ml 蒸餾水即可。原位雜交用 PBS——0.02M phosphate ；
0.5M NaCl(1000ml  蒸餾水加氯化鈉 30g,Na2HPO4·12H2O6g,  NaH2PO4·2H2O
0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序： 注意：zui重要的是及時(shí)固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC 處理，
以抑制RNA 酶對(duì)mRNA 的分解作用。此外，過(guò)度固定對(duì)原位雜交有明顯的不利
影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴(lài)氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細(xì)胞在多聚賴(lài)氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所
用培養(yǎng)基為
Dulbecco 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長(zhǎng)好后0.1M PBS(PH7.4)洗2 分鐘×3 次。
3．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為 4%多聚甲醛/0.1 M
PBS（PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室溫固定20--30 分鐘。蒸餾水充分洗滌
干燥后-20℃冰凍可保存2 周以2
上。
4．30%H2O2 1 份+純甲醇50 份混合，室溫處理30 分鐘。蒸餾水洗滌3 次。
5．暴露mRNA 核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1ml 3%
檸檬酸加2 滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化5—120 秒鐘。有時(shí)也
可以不消化。原位雜交用PBS 洗3 次×5 分鐘。蒸餾水洗1 次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為 1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-
7.6），含有1/1000DEPC。室溫固定10 分鐘。蒸餾水洗滌3 次。
7. 預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml 以保持濕度。按每
張切片20μι
加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42 2—4  ℃ 小時(shí)。吸取多余液體，不洗。
8. 雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交蓋玻片的保
護(hù)膜揭開(kāi)后，
蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過(guò)夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9.  雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的 2×SSC 洗滌 5 分鐘×2 次；
37 0.5×SSC  ℃ 洗滌15 分鐘×1 次; 37 0.2×SSC  ℃ 洗滌15 分鐘×1 次(如果有非特異
性染色，重復(fù)0.2×SSC 洗滌15 分鐘×1-2 次)。
10.滴加封閉液：37 30  ℃ 分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加化鼠抗地高xin：37  60  ℃ 分鐘或室溫120 分鐘。原位雜交用PBS 洗
5 分鐘×4 次。
勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37 20  ℃ 分鐘或室溫30 分鐘。原位雜交用PBS 洗5 分鐘×3 次。勿
用其它緩沖液
和蒸餾水洗滌。
13.滴加化過(guò)氧化物酶：37 20  ℃ 分鐘或室溫30 分鐘。原位雜交用PBS 洗5
分鐘×4 次。
14.DAB 顯色：使用DAB 顯色試劑盒—1ml 蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C 各一滴，
混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30 分鐘。若無(wú)背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配
DAB 顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話(huà)，應(yīng)盡可能地采用新鮮標(biāo)本。標(biāo)本離體后，及時(shí)予以固定。固定
液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），含有1/1000 DEPC。標(biāo)本較大時(shí)用
刀片切成厚度不超過(guò)4mm 的小塊，固定1 小時(shí)即可，較大的標(biāo)本固定不要超過(guò)
2 小時(shí)。某些組織對(duì)過(guò)度固定尤其敏感，如動(dòng)物大腦，固定時(shí)間 30-40 分鐘，一
般不要超過(guò)1 小時(shí)。
1． 常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2． 玻片的處理：一般采用多聚賴(lài)氨酸或APES。
3． 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1 份+蒸餾水10 份混合,室溫5-10 分鐘
以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3 次。
4．暴露mRNA 核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1ml 3%
檸檬酸加2 滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化3--30 分鐘（視標(biāo)本
新舊、厚薄自行調(diào)整）。用戶(hù)可以比較不同的消化時(shí)間，例如5 分鐘,10 分鐘，203
分鐘，30 分鐘。以找到*的消化時(shí)間。原位雜交用PBS 洗3 次×5 分鐘。蒸餾水
洗1 次。其余步驟和冰凍切片6-16 步相同。
結(jié)果觀察：il-6mRNA 的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。
原位雜交的注意事項(xiàng)
原位雜交成套試劑盒，由于采用標(biāo)記的探針和敏感性加強(qiáng)型原位雜交檢測(cè)
試劑盒；使得原位雜交實(shí)驗(yàn)的成功率大大提高，操作也更簡(jiǎn)便。 但仍有一些問(wèn)題
是引起注意的；
1、有條件應(yīng)盡可能用新鮮標(biāo)本，并及時(shí)進(jìn)行固定。固定液為 4%多聚甲醛
(0.1MPBS，PH7.0-7.6)含0.1%DEPC。因?yàn)閙RNA類(lèi)基因容易降解。
2、標(biāo)本的消化對(duì)原位雜交比較重要，適當(dāng)?shù)南瘜⑹拱谢虺浞直┞?，增加?br />針的接觸性。但過(guò)度的消化將使標(biāo)本明顯減薄乃至消失。不同的標(biāo)本對(duì)消化的敏
感性不同。 常用的消化酶有蛋白酶K和胃蛋白酶。大量標(biāo)本實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)仔細(xì)摸索
*的消化條件。蛋白酶K的消化條件為10ug/mL(0.1M TBS,PH7.2-7.6)，37℃
消化1-5分鐘。
3、雜交后的洗滌對(duì)信號(hào)/背景/強(qiáng)度有密切關(guān)系，洗滌時(shí)間越短，信號(hào)越強(qiáng)，背景
也越高；洗滌時(shí)間超長(zhǎng)，信號(hào)越低。適當(dāng)?shù)南礈鞎r(shí)間會(huì)獲得理想的信號(hào)強(qiáng)度和可
以忽略的背景染色。