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人 γ干擾素 (IFN- γ ) 酶聯(lián)免疫 分析（ ELISA ）
試劑 盒使用說(shuō)明書(shū)
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測(cè)定人血清，血漿及相關(guān)
液體樣本 中 γ 干擾素 ( IFN- γ ) 的 含量。
實(shí)驗(yàn)原理 ：
本試劑盒應(yīng)用 雙抗體 夾心法測(cè)定 標(biāo)本 中 人 γ 干擾素 ( IFN- γ ) 水平。用純化的 人 γ 干擾素
( IFN- γ ) 抗體 包被微孔板，制成固相 抗 體，往包被 單抗 的微孔中依次加入 γ 干擾素 ( IFN- γ ) ，
再與 HRP 標(biāo)記的 IFN- γ 抗體結(jié)合，形成抗體 - 抗原 - 酶標(biāo)抗體復(fù)合物 ，經(jīng)過(guò)*洗滌后 加 底
物 TMB 顯色。 TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。
顏色的深淺和樣品中的 γ 干擾素 ( IFN- γ ) 呈正相關(guān) 。 用酶標(biāo)儀 在 450 n m 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度 （ O D
值 ） ， 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線 計(jì)算樣品 中 人 γ 干擾素 ( IFN- γ ) 濃度 。
試劑盒組成 ：
試劑盒組成 48 孔配置 96 孔配置 保存
說(shuō)明書(shū) 1 份 1 份
封板膜 2 片（ 48 ） 2 片（ 96 ）
密封袋 1 個(gè) 1 個(gè)
酶標(biāo)包被板 1 × 48 1 × 96 2-8 ℃ 保存
標(biāo)準(zhǔn)品： 1350pg/ml 0.5ml × 1 瓶 0.5ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml × 1 瓶 1.5ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
酶標(biāo)試劑 3 ml × 1 瓶 6 ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
樣品稀釋液 3 ml × 1 瓶 6 ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
顯色劑 A 液 3 ml × 1 瓶 6 ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
顯色劑 B 液 3 ml × 1 瓶 6 ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
終止液 3ml × 1 瓶 6ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
濃縮洗滌液 （ 20ml × 20 倍） × 1 瓶 （ 20ml × 30 倍） × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
樣本處理及要求 ：
1. 血清 ： 室溫血液自然凝固 10-20 分鐘 ， 離心 20 分鐘左右 （ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分 ） 。 仔細(xì)收集上
清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離 心
20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分 ） 。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次
離心。
3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分 ） 。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程
中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清 ： 檢測(cè)分泌性的成份時(shí) ， 用無(wú)菌管收集 。 離心 20 分鐘左右 （ 2000-3000 轉(zhuǎn) /
分 ） 。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞
濃度達(dá)到 100 萬(wàn) /ml 左右 。 通過(guò)反復(fù)凍融 ， 以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份 。 離心 20 分
鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分 ） 。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。2
5. 組織標(biāo)本 ： 切割標(biāo)本后 ， 稱取重量 。 加入一定量的 PBS ， PH7.4 。 用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br>用。標(biāo)本融化后仍然保持 2-8 ℃ 的溫度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ） ，用手工或勻漿器
將標(biāo)本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分 ） 。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待
檢測(cè)，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上
進(jìn)行試驗(yàn)，可 將標(biāo)本放于 -20 ℃ 保存，但 應(yīng) 避免反復(fù)凍融 .
7. 不能檢測(cè)含 NaN3 的樣品 ，因 NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（ HRP ）活性。
操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10 孔，在*、第二孔中分別加標(biāo)
準(zhǔn)品 100 μ l ， 然后在* 、 第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50 μ l ， 混勻 ； 然后從*孔 、 第二
孔中各取 100 μ l 分別加到第三孔和第四孔 ， 再在第三 、 第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50 μ l ，
混勻 ； 然后在第三孔和第四孔中先各取 50 μ l 棄掉 ， 再各取 50 μ l 分別加到第五 、 第六孔
中 ， 再在第五 、 第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50ul ， 混勻 ； 混勻后從第五 、 第六孔中各
取 50 μ l 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50 μ l ，混
勻后從第七、第八孔中分別取 50 μ l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)
品稀釋液 50 μ l ，混勻后從第九第十孔中各取 50 μ l 棄掉 。 （稀釋后各孔加樣量都為 50 μ l ，
濃度分別為 900 pg/ml ， 600 pg/ml ， 300 pg/ml ， 150 pg/ml ， 75 pg/ml ） 。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同 ） 、 待測(cè)樣
品孔 。 在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40 μ l ， 然后再加待測(cè)樣品 10 μ l （ 樣
品zui終稀釋度為 5 倍 ） 。 加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁， 輕輕 晃動(dòng) 混
勻 。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37 ℃ 溫育 3 0 分鐘 。
4. 配液 ： 將 30 （ 48T 的 20 倍 ） 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 （ 48T 的 20 倍 ） 倍稀釋后備用 。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體， 甩干 ，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此
重復(fù) 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50 μ l ，空白孔除外 。
7. 溫育：操作同 3 。
8. 洗滌：操作同 5 。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 μ l ，再加入顯色劑 B50 μ l ，輕輕震蕩混勻， 37 ℃ 避光顯 色
15 分鐘 .
10. 終止：每孔加終止 液 50 μ l ，終止反應(yīng) （此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色 ） 。
11. 測(cè)定 ： 以空白空調(diào)零 ， 4 50 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的 吸光 度 （ OD 值 ） 。 測(cè)定應(yīng)在加終止
液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
注意事項(xiàng)：
1 ． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未
用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2 ． 濃洗滌液 可能 會(huì)有 結(jié)晶 析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶 ，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
3 ． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器 ， 并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性 ， 以避免試驗(yàn)誤差 。 一次加樣時(shí)間
控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，使用排槍加樣。
4 ． 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線 ， 做復(fù)孔 。 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高 （ 樣本 OD 值
大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD 值 ） ，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測(cè)定 ， 計(jì)
算時(shí)請(qǐng)zui后 乘以 總稀釋倍數(shù)（ × n × 5 ） 。
5 ． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6 ． 底物請(qǐng)避光保存。3
7 ． 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn) .
8 ． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9 ． 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
計(jì)算 ：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)， OD 值為縱坐標(biāo)，
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以 稀釋
倍數(shù) ；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值
代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以 稀釋
倍數(shù) ，即為樣品的實(shí)際濃度。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
1. 樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R 值為 0.92 以上。
2. 批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于 9% 和 15%
檢測(cè)范圍：
30 pg/ml -1000 pg/ml
保存條件及有效期：
1. 試劑盒保存： 2-8 ℃ 。
2 ．有效期： 6 個(gè)月