硝基咪唑類藥物快速檢測(cè)試劑盒

使用說(shuō)明書(shū)

【原理】

本試劑盒是利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔上預(yù)包被抗 硝基咪唑類藥物抗原。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，硝基咪唑類藥物抗體及酶標(biāo)記物，包被抗原和加入樣本中的硝基咪唑類藥物競(jìng)爭(zhēng)性地與硝基咪唑類藥物抗體結(jié)合后，再與酶標(biāo)記物形成抗原抗體復(fù)合物，用TMB底物顯色；加入反應(yīng)終止液，在450nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀下進(jìn)行檢測(cè)，樣品中的硝基咪唑類藥物濃度與吸收光強(qiáng)度成反比。

【適用范圍】

本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的藥物殘留檢測(cè)產(chǎn)品,與儀器分析技術(shù)比較，能經(jīng)濟(jì)、快速地檢測(cè)出肌肉、肝臟等中的硝基咪唑類藥物類藥物。

硝基咪唑類藥物快速檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】   

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度：1ppb

檢測(cè)時(shí)間： 75min

樣本檢測(cè)下限：

組織、蜂蜜………………………………………… 3ppb

牛奶………………………………………………… 40ppb

樣本回收率

組織、蜂蜜……………………………………80% ±10%

牛奶……………………………………………85% ±10%

交叉反應(yīng)率

甲硝唑………………………………………………99%

替硝唑………………………………………………90%

奧硝唑………………………………………………80%

塞克硝唑……………………………………………65%

【試劑盒組成】   

• 微量測(cè)試孔：1×96孔板（12條×8孔）
• 標(biāo)準(zhǔn)品溶液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb
• 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：×1瓶：（1ml/瓶）1ppm
• 酶標(biāo)記物       12ml………………………紅色帽
• 抗體工作液   7ml ………………………綠色帽
• 底物A液      7ml ………………………棕色帽
• 底物B液     7ml  ……………………黑色帽
• 終  止  液     7ml  ……………………黃色帽
• 20X濃縮洗滌液40 ml  ………………白色帽
• 2X 濃縮復(fù)溶液   50ml ·………………藍(lán)色帽

【所用儀器、試劑】   

儀          器：微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、 刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：?jiǎn)蔚?20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

試           劑：乙酸乙酯、NaOH、正己烷

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、0.1M氫氧化鈉溶液

          稱0.4gNaOH加去離子水混勻溶解，定容至100ml

配液2、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復(fù)

溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。

配液3、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19

稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離水）; 或按所需用量配制

洗滌液

【樣本前處理步驟】   

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（1）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

（2）實(shí)驗(yàn)之前須檢查實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（a ）動(dòng)物組織、蜂蜜

1. 稱2.0±0.05g 均質(zhì)過(guò)的樣本于50ml離心管中；
2. 加入3ml 0.1M氫氧化鈉溶液，充分混勻1分鐘
3. 加入4 ml乙酸乙酯充分振蕩5分鐘，室溫4000r/min，離心10分鐘；
4. 取2ml清澈上層有機(jī)相至干凈玻璃試管中，56℃水浴氮?dú)?空氣吹干；
5. 加1ml正已烷振蕩30秒，再加入1ml復(fù)溶工作液充分振蕩混合30秒；室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘；
6. 去除上層有機(jī)相，取下層50µl液體用于分析

      樣本稀釋倍數(shù)：1

（b）牛奶樣品處理方法

脫脂牛奶

1、取出50μl 脫脂牛奶于另一試管中，加入1950μl樣本稀

   釋液，混合30s；

2、取50 μl 用于分析

脂肪奶

3、確吸取1ml 牛奶樣本于離心管中；于15℃環(huán)境

3000r/min，離心10min；（如果沒(méi)有冷凍離心機(jī)請(qǐng)預(yù)

先冷卻后再離心)

4、取出50μl 牛奶于另一試管中，加入1950μl樣本稀

   釋液，混合30s；

5、取50 μl 用于分析

   樣本稀釋倍數(shù): 40 倍

【酶標(biāo)免疫分析程序】   

硝基咪唑類藥物快速檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明操作步驟：

• 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
• 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
• 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置
• 加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
• 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
• 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。重復(fù)步驟6。
• 顯色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
• 測(cè)定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】   

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含硝基咪唑類藥物成負(fù)相關(guān)

1、粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.610；1ppb為1.350；3ppb為1.030；9ppb為0.720； 27ppb為0.359；81ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是27ppb-81ppb； 樣本2的濃度范圍是3 ppb-9 ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中硝基咪唑類藥物實(shí)際含量。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以99%，即：

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以硝基咪唑類藥物濃度（ng /ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中硝基咪唑類藥物實(shí)際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?/span>   

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線

B/B0 (%)

3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

        1         3         9       27      81    

            硝基咪唑類藥物(ppb) [µg/kg]

圖1：硝基咪唑類藥物檢測(cè)試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV

       0        1       3       9        27      81

硝基咪唑類藥物(ppb) [µg/kg]

圖2：硝基咪唑類藥物檢測(cè)試劑盒的精密度

  由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出硝基咪唑類藥物檢測(cè)試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對(duì)相應(yīng)硝基咪唑類藥物濃度作曲線，可以看到全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項(xiàng)】   

• 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒(méi)有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
• 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
• 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
• 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
• 不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。
• 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
• 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
• 該試劑盒反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲(chǔ)存】

原包裝應(yīng)儲(chǔ)存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個(gè)月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號(hào)見(jiàn)外包裝。

【生產(chǎn)企業(yè)】

企業(yè)名稱：齊一生物科技（上海）有限公司

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郵    編：201612               

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