壬基酚ELISA農(nóng)殘試劑盒_美國ABRaxis原裝試劑盒 壬基酚 ELISA 試劑盒用戶操作指南 貨號PN590012
（請以英文為準，中文僅供參考）
壬基酚ELISA農(nóng)殘試劑盒_美國ABRaxis原裝試劑盒 一、有限的保證
Japan EnviroChemicals,Ltd. (the Company, hereunder)保證此產(chǎn)品是按相關(guān)規(guī)定生產(chǎn)的在材料上沒有任何問題。這個保證書規(guī)定：對于問題產(chǎn)品原價賠償或用新的產(chǎn)品替換問題產(chǎn)品。用戶要在收到產(chǎn)品30天內(nèi)向公司提出書面報告，過期不候。另外，這份保證書僅適用于正常使用產(chǎn)品，如果是由于用戶的粗細大意，失誤或不合理的使用造成的問題，本公司概不負責。
產(chǎn)品的設(shè)計在不斷的改進，我們將會對說明書做出相應(yīng)的修改，對此我們將不會提前通知。
二、試劑盒特點 
?AP單克隆抗體特異地與AP結(jié)合，和其它結(jié)構(gòu)相類似的化學物質(zhì)不發(fā)生交叉反應(yīng)。單克隆抗體質(zhì)量穩(wěn)定每批次見幾乎沒有變化。
?檢測范圍5μg/L - 500μg/L (ppb) 。通過固相萃取濃縮可以檢測更低的濃度。
?這個試劑盒有很高的重復性，變異系數(shù)在10%之內(nèi)。
?操作簡單，整個過程僅花費2.5小時
?試劑盒的形式是96孔微孔板，可以同時檢測多個樣品，花費合理。
三、檢測原理 （競爭ELISA）
1. 競爭性反應(yīng) 
這個檢測方法依靠單克隆抗體來識別AP。樣品中的AP和一個AP-酶結(jié)合物預(yù)先混合然后加入到每個微孔中競爭包被在微孔表面的特異性抗體。樣品中AP的濃度如果高于AP-酶結(jié)合物，AP將主要與抗體結(jié)合。反之樣品中AP的濃度如果低于于AP-酶結(jié)合物，AP-酶結(jié)合物將主要與抗體結(jié)合。
2. 顯色反應(yīng) 
通過洗滌步驟去除沒有反應(yīng)的AP和過多的AP-酶結(jié)合物。通過加入底物來檢測AP。和微孔板中抗體結(jié)合的AP-酶結(jié)合物催化底物發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)。通過一個孵育期用稀酸終止反應(yīng)。樣品中AP的濃度越高導致結(jié)合到微孔板抗體上的AP-酶結(jié)合物越少，從而產(chǎn)生的顏色越淡，吸光度越低。
3. 定量分析 
利用已知濃度的AP標準的濃度和在450nm條件下獲得的吸光度值做出一條劑量反應(yīng)曲線（標準曲線）。把樣品的吸光度值用內(nèi)插法插入到標準曲線中可以的計算出樣品中AP的濃度。
四、AP 檢測流程
1.樣品處理
在操作前半小時從冰箱中拿出試劑盒使其恢復到室溫（18-25°C）。過濾樣品，加入甲醇和DMSO使甲醇的zui終濃度為10% (v/v),DMSO的zui終濃度為1%(v/v)。對于一些樣品進行固相萃取是必要的。
2. 標準溶液
利用甲醇溶液（甲醇：水 0.8：8.2）把AP標準濃縮液稀釋10倍。然后對此溶液進一步稀釋成設(shè)定的AP標準的濃度（5μg/L- 500μg/L）。在配制的時候先加甲醇溶液后加標準。
3. 抗原-酶結(jié)合物溶液
重新配制一瓶抗原-酶結(jié)合物溶液：抗原-酶結(jié)合物粉末(#3) + 緩沖液(#4, 白蓋).
4. 標準/樣品 與結(jié)合物混合
在沒有包被的微孔板中(#8)混合100μL AP標準（或樣品）和100μL酶結(jié)合物溶液。先加結(jié)合物后加標準或樣品。
5. 競爭反應(yīng)
在包被抗體的微孔板(#1)的每個孔中加入100μL在第四步中混合的溶液，在室溫(18-25°C)孵育60分鐘。
6. 洗液
用蒸餾水以1：5的比例稀釋洗液（6倍濃縮）：1ml 洗液(#5) + 5ml蒸餾水 
7. 沒有結(jié)合的物質(zhì)
每個微孔用300μL的洗液沖洗，并重復兩次。在吸水紙上用力的排板出去微孔中的液體。
8. 顯色
每個微孔加入100μL顯色試劑(#6, 棕色瓶)，在室溫(18-25°C)孵育30分鐘。然后加入每孔再100μL的終止液(#7, 黑蓋)終止反應(yīng)。
10. 定量
在450nm測定每個標準的吸光度值制作標準曲線。利用內(nèi)插法把樣品的吸光度值代入標準曲線計算樣品中AP的含量。

壬基酚ELISA農(nóng)殘試劑盒_美國ABRaxis原裝試劑盒 五、所需材料
1、試劑盒組成
#     Contents     體積    數(shù)量     儲存
1     MoAb-Coated Microplate  單抗包被微孔板    96 Wells     1 Plate     2-8°C 
2     AP Standard 0μg/L (10%DMSO 20%MeOH)
AP Standard 50μg/L (10%DMSO 20%MeOH)
AP Standard 200μg/L (10%DMSO 20%MeOH)
AP Standard 1000μg/L (10%DMSO 20%MeOH)
AP Standard 5000μg/L (10%DMSO 20%MeOH)    1.5mL/瓶     1瓶/種     2-8°C 
3     Antigen-enzyme Conjugate 抗原-酶結(jié)合物粉末        2 Vials     2-8°C 
4     Buffer Solution – white cap – 緩沖液-白蓋    7mL     2 Vials     2-8°C 
5     Wash Solution (6-fold concentration) 洗液（6x濃縮）    50mL     1 Vial     2-8°C 
6     Color Solution 顯色液（棕色瓶）
- brown vessel -    15mL     1 Vial     2-8°C 
7    Stop Solution – black cap – 終止液-黑蓋    15mL     1 Vial     2-8°C 
8     Uncoated Microplate 沒有寶被抗體微孔板    96 Wells     1 Plate     --- 
9    Plate Cover 微孔板蓋    ---     1     --- 
10    說明書        1    
2、其它必須試劑/材料
1）必需 – 樣品濃縮時不需要
?一次性玻璃試管(e.g. IWAKI, item No. 9831-1207)確保要使用一次性試管避免AP的吸附作用
?玻璃纖維濾器(e.g. ADVANTEC Co., item No. 36481047 Φ47mm)和過濾設(shè)備
?微量加液器(20μL - 200μL 和100μL - 1000μL, e.g. Gilson Pipetman P-200, P-1000)和吸頭
(e.g. ICN Superpack 96NS)
?排槍(50μL - 300μL)
?酶標儀（450nm波長）(e.g. TECAN Sunrise Remote)
?計時器
?Strip ejector (e.g. COSTAR, No.2578) 
?甲醇Methanol (HPLC grade) 
?DMSO(HPLC grade)
2）必需- 通過SPE 濃縮時需要
?以上的材料都需要,再加上下面的材料
?固體萃取柱(e.g. NEXUS SPE Cartridge Producer: VARIAN PART#:1210-3102 ABS ELUT- NEXUS, 200MG 6ML,30/PK)
?丙酮(HPLC grade)
?二氯甲烷(analytical reagent)
3、重要性
如果在試驗過程中使用一些沒有使用過的廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品試劑時需要做比較試驗。 
六、檢測步驟
重要性 
?僅用于研究、不用于個人 
?在操作前半小時從冰箱中拿出試劑盒使其恢復到室溫（18-25°C）。
?不同試劑盒的中的試劑不要混用
?儲存在2-8 °C
?不使用過期產(chǎn)品
?使用完試劑盒后根據(jù)當?shù)氐姆ㄒ?guī)處理廢液。
?為了增加準確性在檢測中做兩個重復。
注意
在試驗中要穿保護性衣服，戴手套和眼鏡保證和試劑盒中的液體接觸。
1．樣品前處理
利用特定的玻璃纖維濾紙(1μm 孔徑)過濾水樣，加入DMSO和甲醇使DMSO終濃度為1% (v/v)、甲醇終濃度
為10% (v/v)。如果濾液要求濃縮和清洗需要固相萃取。
例子
1）將上面制備濾液過NEXUS cartridge柱（已經(jīng)用二氯甲烷(ex. 10ml)、甲醇(ex. 5ml)、蒸餾水(ex. 5ml)提前處理好的），流速10mL/min
2）用蒸餾水(ex. 5ml)和50%蒸餾水/甲醇(ex. 5ml)洗柱。真空干燥柱不超過45分鐘。
3）用二氯甲烷(ex. 6ml)洗脫分析物、然后用氮氣（在30攝氏度或更低的溫度）吹干。
4）加入甲醇和DMSO溶液溶解殘留物，調(diào)節(jié)溶液的終濃度到1%DMSO和10%甲醇溶液。
2.  標準溶液
制備甲醇溶液（甲醇：蒸餾水=0.8 ml/8.2ml）以備稀釋標準(#2, 10% v/v DMSO, 20% v/v
methanol)使用。利用上面制備的甲醇溶液以1：9的比例稀釋AP標準(#2)來配制設(shè)定的AP標準溶液(1% v/v DMSO, 10% v/v methanol)。

1）在配制標準溶液的過程中先加甲醇溶液后加標準(#2)。這樣可以減少AP對試管壁的吸附。
2）使用一次性玻璃試管來稀釋標準，可以減少吸附和污染。
3）如果不經(jīng)過10倍稀釋儲存液的步驟直接稀釋到設(shè)定的標準溶液的濃度，那么標準的真實濃度將要比計劃的濃度要大，所測定的吸光度的值要小0.2-0.5。確保要先稀釋10倍。
4）在測定前制備AP標準溶液，一旦標準溶液從濃縮的狀態(tài)稀釋后就不再穩(wěn)定了，不易保存很長時間。每個檢測過程都要配制新的標準溶液。
5）用移液器吸頭混勻，不要渦旋震蕩器用劇烈震蕩來減少樣品中AP對試管壁表面的吸附。
6）在使用完之后要確保標準濃縮液的蓋擰緊并放在冰箱，標準溶液必須被密封或把蓋擰緊以免甲醇揮
發(fā)。
7）保證標準溶液中甲醇的濃度為10%。過高的甲醇濃度可以損害抗體，太低的濃度導致結(jié)果讀數(shù)不正確。
8）不要隨意處理試驗廢液，要按當?shù)氐姆ㄒ?guī)來處理。
3. 抗原-酶結(jié)合物
重新配制一瓶抗原-酶結(jié)合物溶液：抗原-酶結(jié)合物粉末(#3) + 7ml緩沖液(#4, 白蓋)。
?配制好的溶液要儲存在2-8°C，可以穩(wěn)定地保存2周。
?7mL足夠50個孔使用。
?用移液器吸頭混勻，轉(zhuǎn)移液體時不要產(chǎn)生氣泡。
?在使用的時候配制。
4. 標準/樣品 與結(jié)合物混合
在沒有包被抗體的微孔板中(#8)加入100ul酶結(jié)合物溶液，然后再加入100ul在第二步中配制的AP標準溶液或100μL樣品（制備的1% (v/v) DMSO 和10 % (v/v) 的甲醇溶液）。用移液器吸頭混勻。
?首先加入結(jié)合物溶液然后加入標準或樣品避免孔的內(nèi)表面的非特異性吸附。
?用移液器吸頭混勻，轉(zhuǎn)移液體時不要產(chǎn)生氣泡。
?用1% DMSO 和10%的甲醇溶液做一個空白。
5. 競爭反應(yīng) 
在包被抗體的微孔板(#1)的每個孔中加入100μL在第四步中混合的溶液，輕輕是震蕩微孔板使其內(nèi)部的液體混勻，在室溫(18-25°C)孵育60分鐘。
?包被抗體的酶標板共有12條，每條有8個孔，在檢測前取出所需的孔。然后把不用的再重新放好。
?在轉(zhuǎn)移液體時要確保不產(chǎn)生氣泡，因此操作要輕。
?用膠帶覆蓋微孔板避免污染和液體揮發(fā)。
?在反應(yīng)期間不要移動和振動微孔
?溫度控制在18-30°C
?嚴格反應(yīng)時間
6. 洗液 
用蒸餾水以1：5的比例稀釋洗液（6倍濃縮）(#5)：20ml 洗液(#5) + 100ml蒸餾水 。每次檢測配制所需體積的溶液，每個孔每次要求1.2mL的洗液，整個板需要120 mL。洗液要保存在2-8°C，在配制后大約可以穩(wěn)定保持一個月的時間。
7. 沒有結(jié)合的試劑 
每個微孔用300μL的洗液沖洗，并多重復兩次。在吸水紙上用力的拍板除去微孔中的液體。
?要確保除去任何液體，否則可能引起測量錯誤。
?確保微孔板底部干凈，不要有手印或其它污垢，否則吸光度將有很大改變。
?不要傾倒任何沒有處理的廢液，例如：浸泡的布或紙要燃燒掉。
8. 顯色反應(yīng)
在每個微孔中加入100ul顯色液(#6, brown vessel)。在室溫下孵育30min。然后每個微孔加入100ul終止液(#7,黑蓋)終止反應(yīng)。
?孵育溫度控制在18-30°C
?要使每個孔的反應(yīng)時間一致，尤其在測試多個樣品的時候
?加入終止液后孔中的藍色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色 
9. 定量 
在450nm用酶標儀測定每個標準和樣品的吸光度值。
?在終止反應(yīng)15分鐘內(nèi)測定吸光度值。
?每次檢測制作標準曲線的標準至少做兩個重復。
?確保微孔底面沒有手印和污物，否則測定的吸光度值有很大的改變。
?樣品的檢測范圍5μg/L - 500μg/L，樣品中AP的濃度超過500μg/L時要用10%甲醇+1% DMSO稀釋后再測定。對于*不知情的樣品做前處理時要做遠不止一倍的稀釋。

計算樣品中AP濃度的方法

（1）電腦計算
利用酶標儀分析軟件，用Log-Log (or Log-Linear)曲線。
（2）利用附帶的曲線圖計算

X-axis : NP concentration
Y-axis : Optical Density(OD) or Inhibition Rate(B/B0%)
Inhibition Rate(B/Bo%) = (Sample or standard OD)/(OD at NP standard=0)

七、附件
1、排板上樣設(shè)計
AP單克隆抗體包被的微孔板有96個孔，可以拆成8 x 12條
例1：全板格式
5個不同的AP標準(0, 5, 20, 100, 500μg/L),每個都做兩個重復，共用去10個孔，還留有86個孔，每個樣品做兩個重復可以檢測43個樣品。

例2：部分板的格式
5個不同的AP標準，每個都做兩個重復，共用去10個孔。半個板還有38個孔，每個樣品做2個重復可以檢測19個

2. AP 標準的化學結(jié)構(gòu)

3 交叉反應(yīng)

4. AP 標準曲線
樣品中AP的濃度在5μg/L - 500μg/L范圍內(nèi)可以直接檢測，樣品中AP的濃度超過10μg/L時要用1% (v/v) DMSO and 10% (v/v) 稀釋后再測定。樣品中AP的濃度低于5μg/L時要用固相萃取濃縮后再測定。變異系數(shù)要小于10%。