一.實驗目的
酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA)是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù),ELISA過程包括抗原(抗體)吸附在固相載體上稱為包被，加待測抗體(抗原), 再加相應酶標記抗體(抗原),天生抗原(抗體)--待測抗體(抗原)--酶標記抗體的復合物，再與該酶的底物反應天生有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗體(抗原)的量。待測抗體(抗原)的定量與有色產(chǎn)天生正比。
二.實驗原理
用于免疫酶技術(shù)的酶有很多，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，β-D-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，AchE，6-磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應，在呈色后須立即測定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法正確地定量。
辣根過氧化物酶(HRP)是一種糖蛋白，每個分子含有一個氯化血紅素(protonhemin)區(qū)作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的大吸收峰是275nm，所以酶的濃度和純度計算式是(已知HRP的A(1cm 403nm 1%)=25，式中1%指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶濃度以 mg/ml 計算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP純度(RZ)=A403nm/A275nm純度RZ(Reinheit Zahl)值越大說明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右，
ELISA的主要常用類型及步驟
1. 間接法測抗體
間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體(二抗)以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
2)加稀釋的樣本，保溫反應。樣本中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，樣本中的其他成份在洗滌過程中被洗去。
3)加酶標抗抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗抗體結(jié)合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與樣本中受檢抗體的量正相關(guān)。
4)加底物顯色。
2.雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法是檢測抗原的方法，操作步驟如下：
1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2)加受檢樣本，保溫反應。樣本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3)加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與樣本中受檢抗原的量相關(guān)。
4)加底物顯色。
3.雙抗原夾心法測抗體
反應原理和模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體
4.競爭法測抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。
