1、預(yù)先配制凍存液：

凍存液比例多種，根據(jù)細(xì)胞的特性進(jìn)行調(diào)整凍存液的比例：

5%—10%DMSO + 20%—90%血清 + 0%—70%基礎(chǔ)培養(yǎng)液；

2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗1-2次；去掉培養(yǎng)瓶里的殘余血清；

3、細(xì)胞消化0.5-2min（具體時(shí)間根據(jù)鏡下形態(tài)判斷），顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間不再連接成片，此時(shí)加入*培養(yǎng)基終止消化；

4、用巴氏吸管輕輕吹打細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液1000r/min左右條件下離心3-5min；

5、棄上清，加入適量預(yù)先配制好的凍存液，巴氏吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中的細(xì)胞密度為5×106/ml～1×107/ml；

6、將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1-1.5ml；

7、凍存管標(biāo)記細(xì)胞名稱，凍存時(shí)間，操作者及細(xì)胞代數(shù)信息。對(duì)于懸浮細(xì)胞凍存，則直接收集離心細(xì)胞，其他步驟相同。

注意事項(xiàng):

1、需凍存保種的細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好且存活率高，其密度約為80-90％的狀態(tài)。細(xì)胞凍存前應(yīng)保證細(xì)胞的活力好，無(wú)污染。

2、在細(xì)胞凍存過(guò)程中，所結(jié)的冰晶對(duì)細(xì)胞傷害較大，所以過(guò)程一定要慢。凍存或者復(fù)蘇用新配制的

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