作為一只廢寢忘食的實(shí)驗(yàn)狗走過(guò)的路不是來(lái)自四面八方的套路而是通向?qū)嶒?yàn)成功的“彎路”

ELISA實(shí)驗(yàn)步驟少,流程短,購(gòu)買(mǎi)的ELISA試劑盒也都有指導(dǎo)性很強(qiáng)的操作說(shuō)明書(shū)，單次實(shí)驗(yàn)3-6小時(shí)即可得到結(jié)果,實(shí)驗(yàn)小白也可以很快的上手。但是，各位同學(xué)可不要這樣就輕視哦~，ELISA和WB、IHC等基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)一樣，都是易學(xué)難精，上手容易，但想要得到穩(wěn)定的結(jié)果，不好好做些準(zhǔn)備可是不行的哦~

夾心法ELISA實(shí)驗(yàn)中的捕獲抗體和檢測(cè)抗體是同一個(gè)抗體么?

不是的，在雙抗夾心法ELISA實(shí)驗(yàn)中，會(huì)同時(shí)用到捕獲抗體和檢測(cè)抗體，這兩個(gè)抗體是針對(duì)同一抗原蛋白的不同抗原位點(diǎn)的兩種抗體，這樣才可以同時(shí)結(jié)合抗原分子。這也是雙抗夾心法ELISA不適用與小分子抗原和半抗原等待測(cè)指標(biāo)的原因。

 后面顯示的OD值在多少之間屬于可用值，有要求嗎?

有的,建議標(biāo)準(zhǔn)曲線越高濃度 點(diǎn)的OD值在2.0左右較好,也可參考說(shuō)明書(shū)標(biāo)曲的數(shù)據(jù)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線在推選的濃度下，r2值為0.9，做了多次都是這樣，怎么辦?

這種情況首先要仔細(xì)核對(duì)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),看是否用了推選的擬合方法,如紀(jì)寧生物的ELISA試劑盒,需要使用直線、二項(xiàng)式、四參數(shù)擬臺(tái)方式進(jìn)行擬合，用錯(cuò)擬合方式,會(huì)導(dǎo)致r2值較低;如擬合方式無(wú)誤，需檢查是否有個(gè)別標(biāo)曲孔數(shù)值異常,排查實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是否出現(xiàn)污染或標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋時(shí)出現(xiàn)失誤，導(dǎo)致加樣不準(zhǔn)。

副孔差別比較大，是沒(méi)洗干凈嗎?

復(fù)孔值差異較大，主要原因應(yīng)考慮加樣是否準(zhǔn)確,洗板過(guò)程中是否有殘留以及是否有交叉污染。加樣應(yīng)注意移液器量程,以及槍頭殘留問(wèn)題;洗板過(guò)程應(yīng)注意不要有殘留液體，需要進(jìn)行拍干操作;孵育過(guò)程要更換封板膜,拍干過(guò)程要換吸水紙，避免交叉污染。

ELISA可以檢測(cè)胞內(nèi)蛋白么?

可以的，大部分ELISA指標(biāo)均為炎癥因子、趨化因子等分泌類(lèi)型蛋白，支持的樣本類(lèi)型也多為血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清等液體樣本。如需檢測(cè)胞內(nèi)蛋白,首先需要確認(rèn)待測(cè)指標(biāo)是否在胞內(nèi)表達(dá),然后選用支持組織勻漿樣本的ELISA試劑盒即可,將組織樣品或細(xì)胞樣品進(jìn)行裂解,提取胞內(nèi)蛋白后進(jìn)行蛋白定量,保證每孔上樣總蛋白量一致即可。

同一樣品多次ELISA檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果差異大怎么解決?

應(yīng)考慮的問(wèn)題包括:

●樣本保存不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差較大,樣本應(yīng)盡量減少反復(fù)凍融，如需多次檢測(cè)，需在取樣后分裝保存;

●樣品凍融之后未混勻，應(yīng)混勻后再上樣;

●加樣不準(zhǔn)確，微量樣品加樣時(shí)要注意移液器槍頭不要有殘留。

檢測(cè)樣本是細(xì)胞培養(yǎng)上清，那么細(xì)胞數(shù)目對(duì)炎癥因子的濃度有影響嗎?

有影響，所以不同樣本可以比較的前提條件是培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)水平接近一致。 因不同處理， 可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生產(chǎn)狀態(tài)不同，要保證在鋪板時(shí)接種細(xì)胞數(shù)量水平一致。

整個(gè)過(guò)程需要避光嗎?避光需要避到什么程度呢?

ELISA實(shí)驗(yàn)中。在酶標(biāo)抗體孵育, 以及顯色底物孵育這兩步建議避光，其他步驟無(wú)需避光。避光可采用封板膜覆蓋, 或?qū)⒄麄€(gè)ELISA板子放入暗盒或抽屜等無(wú)光處即可。

封板膜什么時(shí)候用?每次加液后都要換嗎?

封板膜在孵育樣品、檢測(cè)抗體以及HRP酶標(biāo)抗體時(shí)，都要蓋好封板膜, 減少揮發(fā)及污染幾率。每次使用后要更換新的封板膜。

ELISA實(shí)驗(yàn)中的洗板步驟如果沒(méi)有洗板機(jī)，需要如何操作?

實(shí)驗(yàn)室ELISA實(shí)驗(yàn)做的較多,還是建議使用洗板機(jī)洗板,效果更好,也更方便控制。如果沒(méi)有洗板機(jī)，在洗板過(guò)程中,需要注意洗板液添加后不要從孔中溢出, 在加洗板液后, 靜置1-2min，甩干液體后，在吸水紙上大力拍干;重復(fù)三次。

配好的抗體沒(méi)用完如何保存，可保存多久?預(yù)實(shí)驗(yàn)用了一個(gè)試劑盒里面的部分板子和試劑，剩下的板子和試劑還能繼續(xù)用于正式實(shí)驗(yàn)嗎?

針對(duì)紀(jì)寧生物的ELISA試劑盒來(lái)講,在說(shuō)明書(shū)中有各組分拆開(kāi)后的保質(zhì)期， 配好的母液和拆封的板子，可以在四度保存,保質(zhì)期為一個(gè)月左右。剩下的板子和試劑在保質(zhì)期內(nèi)是可以繼續(xù)用于正式實(shí)驗(yàn)的，為保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量, 還是建議間隔時(shí)間不要太長(zhǎng)，一周之內(nèi)更好,需注意試劑避免污染，板子保持干燥。