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ELISA不得不懂的實(shí)驗(yàn)原理 !

時間:2021-9-15閱讀:1474
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ELISA不得不懂的實(shí)驗(yàn)原理 !

ELISA
的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性。

在測定時,受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

由于酶的催化頻率很高,故可極大地地放大反應(yīng)效果,從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度類型及步驟

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ELISA的主要常用類型及步驟

1. 間接法測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體(二抗)以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。

操作步驟如下:

1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗原,洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
2)加稀釋的樣本,保溫反應(yīng)。樣本中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,樣本中的其他成份在洗滌過程中被洗去。

3)加酶標(biāo)抗抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗抗體結(jié)合,從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量與樣本中受檢抗體的量正相關(guān)。

4)加底物顯色。

2. 雙抗體夾心法測抗原

雙抗體夾心法是檢測抗原chang用的方法,操作步驟如下:

1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

2)加受檢樣本,保溫反應(yīng)。樣本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。

3)加酶標(biāo)抗體,保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與樣本中受檢抗原的量相關(guān)。

4)加底物顯色。

3. 雙抗原夾心法測抗體

反應(yīng)原理和模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體

4.競爭法測抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點(diǎn),因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定,可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少,后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

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