細(xì)胞中的蛋白質(zhì)通過合成和降解等活動(dòng)控制處于恒定狀態(tài)。為了使細(xì)胞更，減少不必要的蛋白質(zhì)負(fù)荷，細(xì)胞中的大多數(shù)蛋白質(zhì)都有一個(gè)明確定義的半衰期。細(xì)胞進(jìn)化到降解蛋白質(zhì)的另一個(gè)原因是，確保及時(shí)清除已經(jīng)完成工作的蛋白質(zhì)(如細(xì)胞周期蛋白)，避免由于某些蛋白質(zhì)的構(gòu)成作用而可能發(fā)生的不良影響(如放松管制在細(xì)胞周期蛋白的蛋白酶體降解會(huì)加速不受控制的癌細(xì)胞的擴(kuò)散)。今天上海紀(jì)寧生物將介紹一些常用的測(cè)量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法。

一、脈沖追蹤：

這是一種追蹤蛋白質(zhì)并估計(jì)其穩(wěn)定性的傳統(tǒng)方法，除了涉及到處理放射性，這種方法在測(cè)量蛋白質(zhì)半衰期時(shí)比其他藥理方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)室中仍然經(jīng)常使用。它不僅能測(cè)量蛋白質(zhì)半衰期，而且如果你擅長(zhǎng)放射自顯影和亞細(xì)胞分離，還可以追蹤蛋白質(zhì)并確定其亞細(xì)胞定位。

二、環(huán)己酰亞胺追蹤：

這是一種更簡(jiǎn)單的方法來替代脈沖追蹤和避免放射性的使用。通常，這種方法通過添加環(huán)己酰亞胺來抑制蛋白質(zhì)的合成，然后評(píng)估目的蛋白隨時(shí)間的降解情況。環(huán)己酰亞胺是一種新的蛋白質(zhì)合成抑制劑，通過與60S核糖體單位的E -位點(diǎn)結(jié)合，抑制翻譯的延伸。而這反過來又會(huì)抑制蛋白質(zhì)的合成，使研究人員不必?fù)?dān)心正在進(jìn)行的蛋白質(zhì)合成的影響，就能跟蹤蛋白質(zhì)的降解情況。加入環(huán)己酰亞胺將蛋白質(zhì)合成排除在外，使研究人員能夠?qū)ｉT研究蛋白質(zhì)降解隨時(shí)間的變化。

三、降解途徑的藥理學(xué)抑制劑：

細(xì)胞內(nèi)有兩種主要降解途徑：蛋白酶體途徑和溶酶體途徑。有一些特定的藥理學(xué)抑制劑可用于評(píng)估這兩種途徑的降解。蛋白酶體途徑通過一系列酶將蛋白質(zhì)用泛素標(biāo)記，這種泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)zui終定向到細(xì)胞蛋白酶體復(fù)合物，并在此被降解。但在某些情況下，蛋白酶體降解可能獨(dú)立于泛素化而發(fā)生，在對(duì)可能的降解途徑的假設(shè)進(jìn)行測(cè)試時(shí)，這一點(diǎn)不能忽視。更復(fù)雜的是，泛素化可能也會(huì)在溶酶體降解途徑中發(fā)揮作用。溶酶體降解也被分為許多不同的類型，基于實(shí)際的降解細(xì)胞機(jī)制的細(xì)微差別(大自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬)。

四、降解相關(guān)的翻譯后修飾：

確定了目的蛋白的降解路徑，就可以分析哪些標(biāo)簽(翻譯后修飾，PTM)是這個(gè)過程必須的。有許多類型的PTMs可以標(biāo)記蛋白質(zhì)降解，也有特定的降解基序(降解決定子)，靶向蛋白質(zhì)降解途徑。一些常見的降解決定子如D-boxes，PEST, and KEN boxes，可以幫助蛋白質(zhì)標(biāo)記，并通過各種機(jī)制促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解。一些降解決定子能使蛋白更易接近E3連接酶，E3連接酶可以將其帶到蛋白酶體復(fù)合物中。

五、分析蛋白質(zhì)的泛素化動(dòng)力學(xué)：

蛋白酶體降解往往先于泛素化。檢測(cè)泛素化可以提供一個(gè)強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)，證實(shí)目的蛋白很有可能成為蛋白酶體的靶點(diǎn)。比如拉下目的蛋白，然后使用抗泛素蛋白抗體來評(píng)估其泛素化狀態(tài)。當(dāng)IP樣本被抗泛素抗體檢測(cè)時(shí)，你通常希望看到的是一個(gè)涂片或梯形條帶效應(yīng)。這是因?yàn)椴煌母咝揎椥问降牡鞍踪|(zhì)被識(shí)別，因?yàn)樗鼈冎鸩奖欢鄠€(gè)泛素分子標(biāo)記。在蛋白酶體阻滯后，檢測(cè)到的泛素涂片的強(qiáng)度可能會(huì)變深——表明多泛素化蛋白的積聚。泛素化蛋白是出了名的不穩(wěn)定，并且收集細(xì)胞的具體實(shí)驗(yàn)條件和時(shí)間必須經(jīng)過仔細(xì)的優(yōu)化，以防止在樣本準(zhǔn)備過程中泛素化的丟失。因?yàn)樵谠S多情況下，基于抗體的方法可能由于非特定的下拉。一種更好更清潔的方法是將目的蛋白標(biāo)記his標(biāo)簽，并利用鎳柱親和拉下，評(píng)估蛋白質(zhì)的泛素化。另一個(gè)好的控制方法是使用HA標(biāo)記的泛素質(zhì)粒，并在下拉之前將其與目的蛋白共轉(zhuǎn)染。去除這些質(zhì)粒中的一種或兩種，應(yīng)該減少或甚至消除泛素化。