檸檬酸合酶CS測(cè)試盒_乙醛酸循環(huán)系列_分光法
測(cè)定方法：分光光度法
產(chǎn)品規(guī)格：50管/12樣
注 意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)個(gè)限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一。
測(cè)定原理：
CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶 A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使無(wú)色的 DTNB 轉(zhuǎn)變成的 TNB，在 412nm 處有特征吸光值。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、無(wú)水乙醇和蒸餾水
試劑組成和配制：
試劑一：液體 25mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：液體 5mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：液體 0.5mL×1 支，-20℃保存；
試劑四：液體 28mL×1 瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 1.2mL 蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；
檸檬酸合酶CS測(cè)試盒_乙醛酸循環(huán)系列_分光法
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
①稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
②將勻漿 600g，4℃離心 5min。
③棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
④上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 CS（此步可選做）。
⑤在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 CS 測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 412nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）在試劑五中加入 0.6mL 無(wú)水乙醇和 13mL 試劑四，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其
它物種）孵育 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（2）測(cè)定管：在 EP 管中加入 40μL 樣本、880μL 試劑五和 40μL 試劑六，混勻，37℃反應(yīng) 15min 后立即測(cè)定吸光值 A1。
（3）對(duì)照管：在 EP 管中加入 40μL 樣本、880μL 試劑四和 40μL 試劑六，混勻，37℃反應(yīng) 15min 后立即測(cè)定吸光值 A2。
（4）
計(jì)算 ΔA=A1-A2，每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
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