ELISA試劑盒以其快速、準(zhǔn)確、安全、簡便的特點(diǎn)而成為定量測定生物體內(nèi)微量有機(jī)物的理想方法.為了建立一套快速、有效、方便并能定量測定大鼠MT抗小鼠ELISA試劑盒抗血清法,為動物科學(xué)中的研究和應(yīng)用提供MT的定量測定技術(shù).
1.大鼠MT抗小鼠ELISA試劑盒抗血清的制備:用戊二醛法將純品Zn-MT與載體蛋白(BSA)偶聯(lián)后,作為人工抗原,對大鼠皮下注射.免疫時抗原中MT量分別為6ug/只、12ug/只、24ug/只、48ug/只、96ug/只;加強(qiáng)免疫時所用抗原量依次加倍.前3次免疫時采用的是弗氏*佐劑乳化,后3次免疫采用弗氏不*佐劑乳化. 兩批大鼠加強(qiáng)免疫的時間隔分別為12日和16日.用免疫雙擴(kuò)散方法測定抗血清效價.得出以下結(jié)論:當(dāng)免疫抗原中MT的量為12-24ug/只,每次加強(qiáng)免疫時抗原量加倍,加強(qiáng)免疫間隔時間為10日時,其免疫效果較佳,可使大部分大鼠抗血清效價達(dá)到1:16以上.
2.抗體的純化及鑒定:將效價達(dá)到1:16以上的大鼠MT抗小鼠ELISA試劑盒抗血清血清用飽和硫酸銨鹽析法濃縮出γ-球蛋白,然后用DEAE-Sephadex A50層析柱分離提純IgG.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)洗脫液pH值為7.4時洗脫*峰即為純化的IgG,用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠濃度梯度電泳鑒定層析洗脫下的IgG達(dá)到電泳純.對純化后的IgG進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記,用直接ELISA鑒定其為MT的特異性抗體.
3.ELISA試劑盒的建立:運(yùn)用固相抗原間接非競爭型ELISA試劑盒和固相抗原間接競爭型ELISA試劑盒檢測豬體組織中部分樣品MT的含量,結(jié)果表明:用間接非競爭型ELISA試劑盒測定樣品時其結(jié)果不夠穩(wěn)定,同一樣品所對應(yīng)的0D值相差較大,此方法僅適合于樣品中MT定性檢測;采用間接競爭型ELISA測定樣品,OD值比較穩(wěn)定.用方陣滴定法確定了間接競爭型ELISA的各項(xiàng)具體條件:抗原*包被濃度為6.25ug/ml,一抗(小鼠抗大鼠)使用適宜濃度為50ug/ml,酶標(biāo)抗體(山羊抗大鼠)的使用濃度為1/8000倍,反應(yīng)時間為3hr.用標(biāo)準(zhǔn)MT,采用間接競爭型ELISA試劑盒方法擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=105×2(22.32880-0.39583x),相關(guān)系數(shù)為:R=0.9592.該方法的靈敏度為4.1ng/ml,批間和批內(nèi)變異系數(shù)為9.9760％-14.3858％,在實(shí)際應(yīng)用中有較好的穩(wěn)定性.
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