動物模型是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具，特別是基因工程小鼠和大鼠，在基因功能研究、人類生理病理機制研究及新藥研發(fā)中起著不可替代的作用。近幾年來，制備動物模型的基因修飾技術(shù)層出不窮，這不僅包括傳統(tǒng)ES打靶、TALEN、CRISPR/Cas9， 還有TetraOne基因敲除新技術(shù)。如此繁 多的技術(shù)該如何選擇？本文將對這四種技術(shù)的原理、特點、缺陷及未來發(fā)展趨勢作系統(tǒng)的介紹和對比。
A、傳統(tǒng)ES打靶基因敲除——成熟、修飾準確、效果穩(wěn)定，但制作周期長達一年
基于胚胎干細胞（ES）的同源重組技術(shù)俗稱“傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)”。因具有技術(shù)成熟、修飾準確、效果穩(wěn)定等優(yōu)點而受到眾多科學(xué)家*，此外，世 界上所有重要的的基因敲除小鼠模型均通過此技術(shù)制備。盡管新興核酸酶修飾技術(shù)如ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等相繼出現(xiàn)，但基于ES細胞的 同源重組技術(shù)依然是*可以滿足所有基因組修飾要求的技術(shù)。
基因打靶就是通過同源重組技術(shù)將外源基因定點整合進靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的?；虼虬屑夹g(shù)目前已 被廣泛認為是一種理想的特定修飾與改造生物體遺傳物質(zhì)的有效方法，其中包括了多種不同的基因敲除和敲入系統(tǒng)，特別是條件性和誘導(dǎo)性基因打靶系統(tǒng)的建立，使 得對基因在時間和空間上的靶位修飾更加明確、效果更加可靠。但其存在周期長的缺陷，通常制作周期10-12個月。
B、CRISPR/Cas9基因敲除——周期短，但存在馬賽克現(xiàn)象和脫靶現(xiàn)象
CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats） 是出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術(shù)。 CRISPR是細菌和古細菌為應(yīng)對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的獲得性 免疫防御機制。在這一系統(tǒng)中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans- activating RNA）結(jié)合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶定位點剪切雙鏈 DNA達到對基因組DNA進行修飾的目的。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠?qū)π∈蠛痛笫蠡蚪M特定基因位點進行編輯，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于大小鼠基因的 KO/KI模型制備，其原理也是對目的片段產(chǎn)生特異的切割后，修復(fù)過程中產(chǎn)生移碼突變或者是片段缺失，或者是在切開位置產(chǎn)生片段插入等現(xiàn)象。
C、TALEN基因敲除——周期短，但存在馬賽克現(xiàn)象和脫靶現(xiàn)象
TALEN技術(shù)是一種新的分子生物學(xué)工具?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，來自一種植物細菌的TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應(yīng)關(guān) 系。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達到靶向操作內(nèi)源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能識別任意目標基因序 列，以及識別序列經(jīng)常受上下游序列影響等問題，且具有ZFN相等或更好的靈活性，使基因操作變得更加簡單方便。但因為脫靶的問題，利用TALEN技術(shù)進行 小鼠的基因修飾仍然無法取代傳統(tǒng)技術(shù)。加上存在馬賽克現(xiàn)象，所以在做基因敲入（KI）和其他應(yīng)用時候也必須謹慎的進行檢測。
D、 TetraOne基因敲除——成熟、修飾準確、效果穩(wěn)定，制作周期只需6個月
TetraOne基因敲除是業(yè)界推出的新技術(shù)，沿用ES細胞同源重組的技術(shù)體系，采用*的建系和基因改造技術(shù)建立了具有遺傳優(yōu)勢的TetraOne ES細胞系，通過胚胎發(fā)育前期的顯微注射，使TetraOne ES細胞* 代替內(nèi)源ES細胞，實現(xiàn)跨越“嵌合體”階段從而快速獲得去Neo雜合子小鼠的基因打靶技術(shù)。
TetraOne技術(shù)是基于ES細胞打靶技術(shù)的金標準，通過同源重組技術(shù)將外源基因定點整合進靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造基因組某一基因的目的。同時TetraOneTM 技術(shù)還具有核酸酶技術(shù)周期短的優(yōu)勢，將傳統(tǒng)ES打靶技術(shù)的周期縮短一半，并且不會像核酸酶技術(shù)那樣帶來脫靶效應(yīng)和馬賽克現(xiàn)象，在核酸酶技術(shù)尚未成熟之前，TetraOne技術(shù)將是研究者有效的選擇。
TetraOne基因敲除技術(shù)的原理
TetraOne基因敲除技術(shù)采用*的建系和基因改造技術(shù)建立了具有遺傳優(yōu)勢的TetraOne ES細胞系，通過在胚胎發(fā)育前期進行顯微注射，使TetraOne ES細胞*代替內(nèi)源ES細胞，實現(xiàn)跨越“嵌合體”階段從而一步直接獲得TetraOne小鼠的基因打靶技術(shù)。實驗結(jié)果顯示，TetraOne小鼠的特征均與傳統(tǒng)ES打靶技術(shù)產(chǎn)生的F1代小鼠一致。
