研究進(jìn)展，提供了一種而靈活的方法，可在不同物種中進(jìn)行基因組編輯。然而，這種方法在大型動(dòng)物模型（如山羊）中的適用性和效率，還沒(méi)有得以廣泛的研究。
基因組編輯技術(shù)依靠使用工程核酸酶，來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制，并在不同系統(tǒng)引入可編程的、位點(diǎn)特異性的遺傳修飾。這些可編程的核酸內(nèi)切酶包括鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs），以及zui近開(kāi)發(fā)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)采用短的、單向?qū)?/span>RNA（sgRNA），識(shí)別靶DNA。與ZFN和TALEN相比，RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其靈活、穩(wěn)健的優(yōu)勢(shì)，已被用于不同物種的基因組編輯，包括模式生物、以及農(nóng)作物和對(duì)農(nóng)業(yè)非常重要的動(dòng)物。
山羊作為*批馴養(yǎng)的農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，是zui重要的家畜品種之一，可提供各種產(chǎn)品，包括纖維、牛奶、肉類(lèi)和皮革制品。此外，山羊也被用作生物醫(yī)學(xué)研究的模型。雖然研究人員已在山羊中建立了特定的基因敲除策略（基于同源重組HR和體細(xì)胞核移植SCNT），但是，山羊基因組的基因修飾，仍然是具有挑戰(zhàn)性的。在以往的研究中，研究人員通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的方法，同時(shí)破壞山羊初級(jí)成纖維細(xì)胞的四個(gè)基因，只獲得了肌生成抑制蛋白（MSTN）基因敲除的成纖維細(xì)胞，并通過(guò)SCNT產(chǎn)生了活產(chǎn)山羊。然而，抗生素選擇標(biāo)記盒，對(duì)于從種子供體細(xì)胞分離單細(xì)胞群落，通常是至關(guān)重要的，而且重建胚胎有較低的發(fā)育潛能，從而導(dǎo)致相對(duì)較低的SCNT打靶效率。Cas9?mRNA和sgRNA到單細(xì)胞階段胚胎的共注射，已被證明是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠、大鼠、猴和豬的一種有效方法，這將激勵(lì)我們將這種策略應(yīng)用到山羊的基因打靶中。
在這項(xiàng)研究中，研究人員將靶定兩個(gè)功能基因（MSTN和FGF5）的Cas9?mRNA和sgRNAs，共注射到單細(xì)胞階段的胚胎中，成功地產(chǎn)生了一個(gè)或兩個(gè)基因被修飾的轉(zhuǎn)基因山羊。在體外培養(yǎng)的原代成纖維細(xì)胞中，MSTN和FGF5的打靶效率高達(dá)60%，而在98只試驗(yàn)動(dòng)物中，MSTN和FGF5的修飾效率為分別為15%和21%，雙基因修飾的效率為10%。研究人員對(duì)成纖維細(xì)胞、以及建立者動(dòng)物和死亡動(dòng)物的身體組織和睪丸中靶基因的打靶和脫靶突變進(jìn)行了詳細(xì)分析。結(jié)果表明，他們?cè)诖笮蛣?dòng)物中同時(shí)獲得了幾個(gè)位點(diǎn)的編輯，從而表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)有潛力成為一種強(qiáng)大而的農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因工程工具，因此用于繁殖將是極為重要和適用的。
轉(zhuǎn)基因山羊
研究進(jìn)展，提供了一種而靈活的方法，可在不同物種中進(jìn)行基因組編輯。然而，這種方法在大型動(dòng)物模型（如山羊）中的適用性和效率，還沒(méi)有得以廣泛的研究。
基因組編輯技術(shù)依靠使用工程核酸酶，來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制，并在不同系統(tǒng)引入可編程的、位點(diǎn)特異性的遺傳修飾。這些可編程的核酸內(nèi)切酶包括鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs），以及zui近開(kāi)發(fā)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)采用短的、單向?qū)?/span>RNA（sgRNA），識(shí)別靶DNA。與ZFN和TALEN相比，RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其靈活、穩(wěn)健的優(yōu)勢(shì)，已被用于不同物種的基因組編輯，包括模式生物、以及農(nóng)作物和對(duì)農(nóng)業(yè)非常重要的動(dòng)物。
山羊作為*批馴養(yǎng)的農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，是zui重要的家畜品種之一，可提供各種產(chǎn)品，包括纖維、牛奶、肉類(lèi)和皮革制品。此外，山羊也被用作生物醫(yī)學(xué)研究的模型。雖然研究人員已在山羊中建立了特定的基因敲除策略（基于同源重組HR和體細(xì)胞核移植SCNT），但是，山羊基因組的基因修飾，仍然是具有挑戰(zhàn)性的。在以往的研究中，研究人員通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的方法，同時(shí)破壞山羊初級(jí)成纖維細(xì)胞的四個(gè)基因，只獲得了肌生成抑制蛋白（MSTN）基因敲除的成纖維細(xì)胞，并通過(guò)SCNT產(chǎn)生了活產(chǎn)山羊。然而，抗生素選擇標(biāo)記盒，對(duì)于從種子供體細(xì)胞分離單細(xì)胞群落，通常是至關(guān)重要的，而且重建胚胎有較低的發(fā)育潛能，從而導(dǎo)致相對(duì)較低的SCNT打靶效率。Cas9?mRNA和sgRNA到單細(xì)胞階段胚胎的共注射，已被證明是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠、大鼠、猴和豬的一種有效方法，這將激勵(lì)我們將這種策略應(yīng)用到山羊的基因打靶中。
在這項(xiàng)研究中，研究人員將靶定兩個(gè)功能基因（MSTN和FGF5）的Cas9?mRNA和sgRNAs，共注射到單細(xì)胞階段的胚胎中，成功地產(chǎn)生了一個(gè)或兩個(gè)基因被修飾的轉(zhuǎn)基因山羊。在體外培養(yǎng)的原代成纖維細(xì)胞中，MSTN和FGF5的打靶效率高達(dá)60%，而在98只試驗(yàn)動(dòng)物中，MSTN和FGF5的修飾效率為分別為15%和21%，雙基因修飾的效率為10%。研究人員對(duì)成纖維細(xì)胞、以及建立者動(dòng)物和死亡動(dòng)物的身體組織和睪丸中靶基因的打靶和脫靶突變進(jìn)行了詳細(xì)分析。結(jié)果表明，他們?cè)诖笮蛣?dòng)物中同時(shí)獲得了幾個(gè)位點(diǎn)的編輯，從而表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)有潛力成為一種強(qiáng)大而的農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因工程工具，因此用于繁殖將是極為重要和適用的。
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