植物組織中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白質(zhì)的系列測定
一、目的
從一份植物樣品中系統(tǒng)分離和測定可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白質(zhì)等多種成分，不僅對研究植物體內(nèi)碳、氮代謝，了解植物的生長發(fā)育狀況有重要意義，也可以作為鑒定其品質(zhì)的重要指標(biāo)，另外也有助于訓(xùn)練基本操作技能。
二、原理
（一）、分離提取原理
在80%～85%的乙醇中，植物組織中的還原糖、蔗糖以及游離氨基酸和葉綠素等溶解，而淀粉及蛋白質(zhì)沉淀，再用9.2mol/L高氯酸溶解淀粉（蛋白質(zhì)沉淀），zui后用0.1mol/L氫氧化鈉溶解蛋白質(zhì)。選用適當(dāng)?shù)姆椒y定各個(gè)提取液中相應(yīng)物質(zhì)的含量。
（二）、測定原理
1、蒽銅比色法——可溶性糖含量測定
碳水化合物及其衍生物經(jīng)濃硫酸處理，生成糠醛，再與蒽銅脫水縮合而生成藍(lán)綠色化合物，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與碳水化合物含量呈現(xiàn)性關(guān)系。蒽銅反應(yīng)的顏色深淺，隨溫度條件和加熱時(shí)間而變化，葡萄糖顯色高峰在100℃時(shí)，加熱10min后出現(xiàn)，而核糖在相同溫度下，加熱3min后出現(xiàn)。此法靈敏度高，糖含量達(dá)30ug即可測定。
2、茚三酮比色法——氨基酸含量測定
氨基酸的游離氨基與水合茚三酮作用后，產(chǎn)生二酮茚胺的取代鹽等藍(lán)紫色化合物，在570nm下有zui大光吸收。在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與氨基酸的含量呈正比。
3、考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合法——蛋白質(zhì)含量測定
考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)時(shí)呈紅色，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，后者zui大光吸收在595nm，在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量呈正比。此法快速靈敏，反應(yīng)在2min內(nèi)即達(dá)到平衡，室溫1h內(nèi)顏色穩(wěn)定，而且干擾物也少。
三、實(shí)驗(yàn)用品
（一）、實(shí)驗(yàn)材料
植物樣品
（二）、器皿
1、25mL刻度試管×8,15mL試管×20.
2、10mL離心管×2
3、容量瓶：50mL×1,25mL×1
4、移液管：5mL×2,2mL×4,1mL×2,0.1×2.
5、洗耳球
6、恒溫水浴鍋
7、離心機(jī)
8、電子天平
9、分光光度計(jì)
（三）、試劑
1、樣品分離提取
（1）、、80%乙醇
（2）、9.2mol/L高氯酸，4.6mol/L高氯酸
（3）、0.1mol/L氫氧化鈉
2、可溶性糖及淀粉測定
（1）、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：0.1g*溶于蒸餾水中，定容至1000mL。
（2）、硫酸-蒽酮試劑：0.2g蒽酮，1g硫脲，緩緩加入100mL濃硫酸，邊加邊攪拌，溶解后呈黃色透明溶液，儲(chǔ)于棕色瓶中，4℃冰箱中保存。
3、氨基酸測定
（1）、60%乙醇
（2）、水合茚三酮：1.2g茚三酮，加入30mL正丙醇，攪拌使其溶解，再加入60mL正丁醇和120mL乙二醇，zui后加入18mL pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖液混勻，儲(chǔ)于棕色瓶，4℃冰箱中保存。
（3）、乙酸-乙酸鈉緩沖液：乙酸鈉54.4g，加入100mL蒸餾水，在電爐上加熱至沸，使體積蒸發(fā)至原體積的一半，冷卻后加30mL冰醋酸，用蒸餾水稀釋至100mL。
（4）、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸：取80℃下烘干的*20mg，溶解在10%的異丙醇中，并用10%異丙醇稀釋至10mL，取5mL用蒸餾水稀釋至50mL。
（5）、0.1%抗壞血酸：50mg抗壞血酸溶于50mL蒸餾水中。現(xiàn)用現(xiàn)配。
4、蛋白質(zhì)含量測定
（1）、牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：100mg牛血清白蛋白溶于100mg蒸餾水中，儲(chǔ)于4℃冰箱中，
（2）、考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶解于50mL95%乙醇中，加入85%磷酸mL，用蒸餾水定容至1000mL。
四、操作步驟
（一）、分離提取
每次離心轉(zhuǎn)速3000～3500r/min
（二）、測定
1、可溶性糖及淀粉的測定
（1）、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
加入硫酸-蒽酮試劑時(shí)，將各管放在冷水中，沿管壁緩緩加入，全部加完后再混勻。將以上各管在100℃水浴中加熱10min，取出后用自來水冷卻，620nm比色測定。
（2）、樣品測定
取可溶性糖提取液1mL+1mL蒸餾水，顯色與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同
2、淀粉測定
吸取上述淀粉提取液2mL于大試管中，用測定可溶性糖的方法測定。
3、游離氨基酸含量測定
（1）、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
加完試劑后混勻，置沸水浴加熱15min，然后取出放在冷水中迅速冷卻并搖動(dòng)，使加熱時(shí)形成的紅色逐漸被氧化而褪色，直至溶液呈紫色時(shí)，用60%的乙醇定容至10mL，混勻，570nm比色測定。
（2）、樣品測定
吸取上述樣品提取液2mL，顯色與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。
4、蛋白質(zhì)含量測定
（1）、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
混勻后，分別準(zhǔn)確吸取各試管0.1mL至另外6個(gè)試管中，加5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻，放置2min后595nm比色測定。
（2）、樣品測定
準(zhǔn)確吸取蛋白質(zhì)提取液0.1mL，顯色與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。
會(huì)員1.png)