Ca++ Mg++- ATP 酶活性測(cè)定說(shuō)明書(shū)
分光光度法 50 管/24 樣
測(cè)定意義：
Ca++ Mg++-ATP 酶廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物和細(xì)胞中，可催化 ATP 水解生成 ADP 和無(wú)機(jī)磷。
測(cè)定原理：
根據(jù) Ca++ Mg++-ATP 酶分解 ATP 生成 ADP 及無(wú)機(jī)磷，通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量來(lái)確定 ATP 酶活性高低。
需自備的儀器及用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液： 液體 50mL ×1 瓶，4℃保存。試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：液體 5ml×1 瓶，4℃保存。
試劑四：粉劑×3 支，-20℃保存。用時(shí)每支加 1mL 蒸餾水，現(xiàn)用現(xiàn)配。用不完的試劑-20℃可保存一周。
試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。
試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時(shí)加入 3mL 蒸餾水， 4℃保存。
試劑七：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入 25mL 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周。試劑八：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入 25mL 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周。試劑九：液體 25mL×1 瓶，室溫保存。
試劑十：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑十 20 倍稀釋?zhuān)慈?/span> 0.1mL 試劑十加 1.9mL 蒸餾水充分混勻。
定磷劑的配制：按 H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：配試劑用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
樣品酶液的制備：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
操作步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 660nm，蒸餾水調(diào)零。
2、酶促反應(yīng)（在 EP 管中加入下列試劑）
| | 對(duì)照管 | | | 測(cè)定管 | | |
| | | | | | | | |
試劑一（μL） | | 130 | | 90 | | |
| | | | | | | | |
試劑二（μL） | | 40 | | 40 | | |
| | | | | | | | |
試劑三（μL） | | 40 | | 40 | | |
| | | | | | | | |
試劑四（μL） | | 40 | | 40 | | |
| | | | | | | | |
試劑五（μL） | | | | 40 | | |
| | | | | | | | |
樣本 （μL） | | | | 200 | | |
| | | | | | | | |
混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴 10min | | |
試劑六（μL） | | 50 | | 50 | | |
樣本 （μL） | | 200 | | | | | | |
| 混勻，8000g，常溫離心 10min，取上清液 | | |
3 定磷（1.5mLEP 管中依次加入下列試劑） | | | | | | |
| | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | | 對(duì)照管 | | 測(cè)定管 | |
| | | | | | | |
0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液（μL） | | 100 | | | | | |
| | | | | | | |
上清液（μL） | | | | 100 | | 100 | |
| | | | | | | |
蒸餾水（μL） | 100 | | | | | | |
| | | | | | | |
定磷試劑（μL） | 1000 | 1000 | | 1000 | | 1000 | |
| | | | | | | | |
混勻，37℃水浴 30 min，冷卻至室溫，在 660nm 處比色。注意事項(xiàng)：
1、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照，本試劑盒 50 管只能測(cè) 24 份 Ca++ Mg++-ATP 酶。2、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無(wú)磷。避免磷污染是檢測(cè)成敗的關(guān)鍵。
3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。
計(jì)算
1、血清（漿）Ca++ Mg++- ATPase 活力的計(jì)算:
定義：規(guī)定每小時(shí)每毫升血清（漿）中 Ca++ Mg++- ATP 酶分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力（U/mL）=[ C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A
空白管）÷V 樣÷T=7.5×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）組織中 Ca++ Mg++- ATPase 的計(jì)算：
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 Ca++ Mg++- ATPase 活力的計(jì)算：（1）按蛋白濃度計(jì)算：
定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白中 Ca++ Mg++- ATP 酶分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/ mg)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷（V 樣×Cpr）÷T =7.5×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
定義：每小時(shí)每克組織中 Ca++ Mg++-ATP 酶分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/g)= [C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=7.5×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
定義：規(guī)定每小時(shí)每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞中 Ca++ Mg++-ATP 酶分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/104)= [C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.015×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）
C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V 總：酶促反應(yīng)總體積，0.5mL；V 樣：加入樣本體積，0.2mL ；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1/6 小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。
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