人類(lèi)外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)
通常情況下哺乳動(dòng)物外周血中是沒(méi)有分裂細(xì)胞的，只有在宜昌情況下才能發(fā)現(xiàn)。外周血中的小淋巴細(xì)胞幾乎都處于G1期貨G0期的非增殖狀態(tài)。太歪培養(yǎng)時(shí)經(jīng)一定劑量的植物血凝集素（PHA)刺激，T淋巴細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣?xì)胞，重新進(jìn)入增殖周期，進(jìn)行有絲分裂。外周血中淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)68-72小時(shí)（三個(gè)周期）的短期培養(yǎng)，即可產(chǎn)生大量的增殖期細(xì)胞群。用*（細(xì)胞分裂阻斷劑）積累分裂相，可使處在分裂期的淋巴細(xì)胞停留在分裂中中期或在中期，從而獲得足夠的可供分析的中期分裂相。
1、培養(yǎng)液配制（在超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌操作）
每個(gè)培養(yǎng)瓶（容積30ml）中加入5ml培養(yǎng)液，其中含：
RPMI1640 4ml
滅活小妞血清 1ml、
PHA 2.5mg
* 500U
* 500ug
依次將上訴試劑加入培養(yǎng)瓶中，反復(fù)吹打使其混合均勻，用5%NaHCO3調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH至7.2-7.4.
2、血樣本的采集 先以碘酒和75%乙醇溶液消毒皮膚。用2ml滅菌注射器吸取月0.2ml肝素，作精美穿刺，抽取外周靜脈血1ml。轉(zhuǎn)動(dòng)鎮(zhèn)痛以混勻肝素。
3、接種 常規(guī)消毒后，立即將針頭插入滅菌小瓶?jī)?nèi)，送入超凈工作臺(tái)，在火焰旁將血液滴入2-3個(gè)盛有5ml培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶0.2-0.3ml（6號(hào)針頭45度傾斜，約20滴）蓋上橡皮塞，輕輕搖動(dòng)以混勻。貼好標(biāo)簽，將培養(yǎng)瓶放在37℃恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)72小時(shí)。
4、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、材料 人外周靜脈血（肝素抗凝）
2、培養(yǎng)基：RPMI1640，按說(shuō)明書(shū)配制后抽濾、分裝，凍存?zhèn)溆谩?/span>
3、小牛血清：冰凍保存，用時(shí)在56℃水浴條件下滅活。
4、植物血凝集素(PHA)：按說(shuō)明書(shū)要求使用。
5、抗生素：*：50000u/ml，*：50000ug/ml，用無(wú)菌生理鹽水配制。培養(yǎng)液中的終濃度為100u/ml5%NaHCO3溶液。
器材 超凈工作臺(tái)，37℃恒溫培養(yǎng)箱，酒精燈，*（1ml、2ml、5ml）針頭、培養(yǎng)瓶、橡皮塞、75%乙醇溶液棉球，*、離心機(jī)，定時(shí)鐘，試管架、*子。
注意事項(xiàng)
1、PHA是體外淋巴細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵問(wèn)題，因此要考慮它的質(zhì)量和濃度。鹽水提取物一般冷凍保存的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，時(shí)間成了效價(jià)降低。濃度一般用1%=2%，每毫升培養(yǎng)液加0.2-0.4ml濃度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集
2、培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)控制在（37±0.5℃），溫度過(guò)高或過(guò)低俊輝影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
3、培養(yǎng)基的ph應(yīng)該在7.2-7.4左右，低了細(xì)胞生長(zhǎng)不良，高了細(xì)胞則會(huì)出現(xiàn)輕度的固縮。
會(huì)員1.png)