腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，
AGP）活性測定試劑盒說明書
分光光度法 25 管/24 樣
測定意義
AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸與 ATP 反應(yīng)生成淀粉合成的直接前體 ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。
測定原理
AGP 催化的逆向反應(yīng)生成 G1P，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，340nm 下測定 NADPH 增加速率，即可計(jì)算
AGP 活性。
需自備的的儀器和用品
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制
提取液：液體 30mL×1 瓶，4℃保存;試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 支，4℃保存；臨用前加入 250μL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑仍 4℃ 保存；試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 2mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑仍 4℃ 保存；
試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 3mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑仍 4℃ 保存；試劑五：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 3mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 250μL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑 4℃ 保存；試劑七：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 250μL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑 4℃ 保存；
粗酶液制備
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、試劑一置 30℃保溫 10min 以上。
2、在 EP 管中按順序加入下列試劑（如果一次性測定樣本較多，可以將試劑一、二、三和四按比例配成混合液 1，將試劑一、五、六和七按比例配成混合液 2）
試劑名稱（μL） | 測定管 |
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試劑一 | 100 |
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試劑二 | 10 |
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試劑三 | 50 |
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試劑四 | 100 |
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樣本 | 20 |
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混勻，30℃保溫 15 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴迅速冷卻
試劑一 | 300 |
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試劑五 | 100 |
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試劑六 | 10 |
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試劑七 | 10 |
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混勻后立即在 340 nm 波長下記錄初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
AGP 活性計(jì)算
1、按樣本蛋白蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活性單位。
AGP（U/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=2813×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。2、按照樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
AGP（U/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T
=2813×ΔA÷W
V 反總：反應(yīng)體系總體積，7×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103mol/L/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。
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