液相色譜法是以液體作為流動(dòng)相,并采用顆粒極細(xì)的固定相的柱色譜分離技術(shù)。液相色譜對(duì)樣品的適用性廣,不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制,因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中,可用氣相色譜分析的約占20%,而80%則需用液相色譜來分析。液相色譜根據(jù)分離機(jī)理的不同可分為液液分配色譜、液固吸附色譜、離子交換色譜和排斥色譜(或凝 膠滲透色譜)。液相色譜已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物的含量測(cè)定、組成分析、質(zhì)量控制等方面。 近年來液相色譜法在藥物分析中占主要地位。據(jù)美國(guó)藥典22版載,HPLC在含量測(cè)定方法中位居*。其特點(diǎn)是分析速度快、分離效率高、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)自動(dòng)化、適用范圍廣、組分易回收、樣品處理較簡(jiǎn)單 。本文在按在藥物分析中的作用從以下幾個(gè)方面綜述了液相色譜法在藥物分析的研究進(jìn)展。
1、在天然藥物及復(fù)方成藥分析中的應(yīng)用
ELSD能夠測(cè)定沒有紫外吸收或?yàn)樽贤饽┒巳跷盏臉悠?，天然產(chǎn)物中的許多成分無疑找到了直接、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。ELSD在天然產(chǎn)物及其復(fù)方成藥分析中的應(yīng)用報(bào)道主要有皂苷類、生物堿類、萜類內(nèi)酯等。皂苷無紫外吸收或僅為末端吸收，ELSD能夠?qū)ζ洳唤?jīng)衍生進(jìn)行檢測(cè)，在HPLC—ELSD的應(yīng)用中這方面的報(bào)道zui多。主要有一次性分離分析天然人參、生脈散復(fù)方、育精膠囊中的多種人參皂苷；西洋參中的人參皂苷和擬人參皂苷定量測(cè)定；三七中的三七皂苷的含量分析；黃芪、*和保元湯中的黃芪皂苷、黃芪甲甙的分離和測(cè)定；麥冬中的甾體皂甙元；天麻中的天麻甙的含量測(cè)定等。這些研究主要采用Cl8柱、乙晴與水作流動(dòng)相，不經(jīng)衍生直接測(cè)定多組分含量，結(jié)果顯示方法靈敏度高(一般檢測(cè)限低于3μg／m1)、線性關(guān)系良好。對(duì)于無紫外吸收的生物堿類成分，ELSD同樣顯示出操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)比HPLC—UV法測(cè)定貝母中的甾類貝母生物堿，采用ELSD檢測(cè)器，不但不需衍生化操作，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確度，而且可檢測(cè)出不含雙鍵的貝母甲素，對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的生物堿類成分如河豚du素，無紫外吸收且安全性低，不適合衍生化法，可用ELSD法進(jìn)行檢測(cè)，獲得滿意結(jié)果。銀杏作為一種保健藥品，其主要活性成分為黃酮類和萜類內(nèi)酯，以往銀杏中的萜類內(nèi)酯成分主要采用HPLC—UV法和HPLC—RI測(cè)定，但由于萜類內(nèi)酯紫外吸收差，又含少量物質(zhì)的干擾，結(jié)果穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性較差．隨著ELSD的發(fā)展和普及，這些方法已經(jīng)逐漸被ELSD法所取代。
2、液相色譜在抗生素分析中的應(yīng)用
HPLC—ELSD早在20世紀(jì)九十年代就用于天然產(chǎn)物分析，隨著技術(shù)的發(fā)展，其應(yīng)用范圍已逐漸擴(kuò)大，近年來屢有用HPLC—ELSD分析抗生素類藥物的報(bào)道，HPLC—ELSD分析抗生素類藥物的報(bào)道多見于氨基糖苷類抗生素、氨基糖苷類抗生素是臨床上常用的抗生素，可通過微生物發(fā)酵或半合成制得，是一類單組分或多組分糖基取代的氨基環(huán)醇類化合物，主要有：*、*、*、*、*等。對(duì)這一類抗生素的含量測(cè)定多采用微生物法，但微生物法測(cè)定的是各活性組分的總量，無法反映各組分組成。為克服這個(gè)缺點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外的藥典采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定，但這類抗生素?zé)o紫外吸收，只能采取衍生化法(多為柱前衍生)，結(jié)果易受衍生化反應(yīng)條件的影響而不夠準(zhǔn)確，ELSD法很好地解決了這個(gè)問題。氨基糖苷類抗生素含多個(gè)氨基，可產(chǎn)生含不同當(dāng)量無機(jī)酸鹽產(chǎn)品，對(duì)于這些副產(chǎn)物成分，ELSD也能很好的加以測(cè)定。
3、液相色譜作為常規(guī)分析方法在藥物分析中的應(yīng)用
液相色譜法作為藥物分析中的zui主要的分析方法,常被作為常規(guī)分析和檢驗(yàn)方法。近年來在這個(gè)方面的研究比較多,劉樹業(yè)等為時(shí)刻監(jiān)控治療肝癌時(shí)的抗癌藥物劑量即血中的藥物濃度,提高療效,減少副作用,采用紫外-HPLC法對(duì)血中和組織中的*濃度進(jìn)行分析.用UV-240紫外分光光度計(jì),BECKMAN332型液相色譜儀,采用反向色譜法。針對(duì)近幾年奧委會(huì)醫(yī)學(xué)委員會(huì)公布的禁用表中新增藥物及一系列利尿劑的相關(guān)化合物進(jìn)行了研究,比較了不同的提取方法及回收率,研究了幾種藥物的排泄情況;建立了同時(shí)分析13種利尿劑的液相色譜測(cè)定方法,檢出限小于5ng。用0.02mol/L的三羥甲基胺基甲烷(用磷酸調(diào)pH值至7)和甲醇(含2%乙酸和0.25%庚烷磺酸鈉)作流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,建立了脂性油膏藥物中黃芩甙含量的反相液相色譜分析方法,本法分析速度快,重現(xiàn)性好,黃芩甙的平均回收率為103.7%。
4、液相色譜 - 熒光衍生法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用
體內(nèi)藥物分析是在大量復(fù)雜組分中進(jìn)行微量或超微量藥物及代謝產(chǎn)物的測(cè)定。體內(nèi)藥物分析zui常用的檢品是血樣(血漿、血清、全血)、尿樣、唾液及組織液, 特殊情況下也采用乳汁、淚液、膽汁、羊水、糞便等[1]。隨著藥物的開發(fā)研究, 藥物的服用劑量越來越小, 體內(nèi)藥物的濃度越來越低, 這對(duì)分析方法靈敏度和選擇性等都提出很高的要求[2]。液相色譜法具有準(zhǔn)確、靈敏度、專一性強(qiáng)等特點(diǎn), 一直是體內(nèi)藥物分析的主要手段[3]。而液相色譜的熒光檢測(cè)器比紫外吸收檢測(cè)器靈敏度高。具有強(qiáng)紫外吸收的化合物檢測(cè)靈敏度可達(dá) ng水平, 而熒光衍生物一般的檢測(cè)水平為 10-12～10-14m ol/L,靈敏度比紫外檢測(cè)器提高 10～1000 倍[4]。故 H PLC 法結(jié)合熒光檢測(cè)法所具有的較高的選擇性及靈敏度以及試樣用量少的特性, 使得對(duì)復(fù)雜生物樣品中藥物及其代謝物的測(cè)定變得更加靈敏、準(zhǔn)確、快速。但熒光檢測(cè)器要求被檢測(cè)樣品能被激發(fā)產(chǎn)生熒光. 對(duì)于不產(chǎn)生熒光或熒光較弱的樣品靈敏度很低, 甚至不能檢測(cè)。為了擴(kuò)大檢品范圍, 提高檢測(cè)靈敏度, 常采用熒光衍生法。熒光衍生法是指在一定條件下利用某種試劑與樣品中待測(cè)組分相作用, 使其產(chǎn)物具有熒光或熒光增強(qiáng)。另外,熒光檢測(cè)器選擇性好, 過量的試劑和副產(chǎn)物往往不產(chǎn)生干擾, 衍生物亦不必純化, 因此熒光衍生技術(shù)的采用, 擴(kuò)大了液相色譜 - 熒光測(cè)定法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用范圍, 為藥物代謝動(dòng)力學(xué), 臨床藥理學(xué)和毒理學(xué)等研究提供科學(xué)依據(jù)。
5、液相色譜在藥物殘留測(cè)定上的應(yīng)用
由于液相色譜能夠?qū)繌?fù)雜組分進(jìn)行定量分析,被廣泛使用于藥物殘留的測(cè)定上。以液相色譜法建立了豬、羊、雞肝組織中西維因殘留量的檢測(cè)方法。采用ODS色譜柱,二極管陣列檢測(cè)器,甲醇/水(65/35)為流動(dòng)相,222nm檢測(cè)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。西維因?qū)φ掌啡芤旱膠ui低檢測(cè)限為0.1mg/L,線性范圍為0.1～20mg/L,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=-22459.83+454684.31x,線性關(guān)系良好(r=0.9999)。樣品以乙腈提取,并加入*和正已烷,過濾后去除雜質(zhì),乙腈層在45～50℃下水浴氮?dú)獯蹈?殘?jiān)眉状既芙夂?進(jìn)樣分析。平均回收率均大于80%,日間和日內(nèi)變異系數(shù)均小于10%。符合藥物殘留痕量分析要求。研究了動(dòng)物源性食品中甲氧芐胺嘧啶藥物殘留的提取、凈化和液相色譜分析條件,建立了液相色譜法測(cè)定動(dòng)物性食品中甲氧芐胺嘧啶藥物殘留的方法,該法檢測(cè)限0.025mg/kg,回收率為84%～98%。此外,在人血中藥物含量的測(cè)定中也有很多的應(yīng)用。建立了血漿及尿液中異煙肼的液相色譜快速測(cè)定方法,以滿足臨床藥物分析和法醫(yī)學(xué)鑒定的需要,提高對(duì)血漿及尿液中異煙肼濃度檢測(cè)的準(zhǔn)確性。以*為衍生化試劑,將異煙肼經(jīng)柱前衍生為異煙肼*腙,直接對(duì)處理后樣品中的腙進(jìn)行定性、定量分析。以在空白人體液樣本中定量添加標(biāo)準(zhǔn)異煙肼的方法考察了樣品的前處理方法、儀器條件、線性范圍、精密度、回收率等,并對(duì)健康受試者血液中的異煙肼濃度進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。
液相色譜法由于分析速度快、分離效率高、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)自動(dòng)化、適用范圍廣、組分易回收、樣品處理較簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)在確定藥方案和治療劑量,以及藥物動(dòng)力學(xué)分析和藥效學(xué)評(píng)價(jià)提供了方法的基礎(chǔ),有著廣泛的應(yīng)用前景。
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