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中級(jí)會(huì)員 | 第11年

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羧肽酶的理化性質(zhì)

時(shí)間:2017/1/4閱讀:1421
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 羧肽酶是一種消化酶??蓪R恍缘貜碾逆湹腃端開(kāi)始逐個(gè)降解,釋放出游離氨基酸的一類肽鏈外切酶。以酶原形式存在于生物體內(nèi)。常用的有A、B、C及Y ,4種羧肽酶。

   羧肽酶A能水解蛋白質(zhì)和多肽底物C端芳香族或中性脂肪族氨基酸殘基,釋放除脯氨酸、羥脯氨酸、精氨酸和賴氨酸之外的所有C末端氨基酸,更易于水解具有芳香族側(cè)鏈和大脂肪側(cè)鏈的羧基端氨基酸。比如酪氨酸,苯丙氨酸,丙氨酸等。 羧肽酶A(carboxypeptidase A),CPA, 因其底物的*字“A”而得名羧肽酶A 。

  羧肽酶Y以酶原的形式存在于酵母細(xì)胞中,在分離制備時(shí),首先用有機(jī)溶劑使酵母細(xì)胞自溶破裂,然后在pH5.0進(jìn)行活化,將酶原轉(zhuǎn)變成酶。經(jīng)DEAE-纖維素柱層析除去大量雜蛋白,再用DEAE-sephadexA-50柱進(jìn)行純化。必要時(shí)再通過(guò)sephadexG-150柱,可得到更純的酶。經(jīng)過(guò)以上分離純化步驟后,酶可提純400倍以上。用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定為一條帶。

  自1967年發(fā)現(xiàn)此酶以來(lái),人們對(duì)它的理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)以及應(yīng)用等方面進(jìn)行了研究。每分子羧肽酶Y約含有16個(gè)氨基葡萄糖(glucosamine)殘基和15%的己糖。其氨基酸組成中,酸性氨基酸含量較高,等電點(diǎn)為3.6。分子量約為61000Da,在280nm的消光系數(shù)為15.0。酶活性可被二異丙基氟磷酸(DFP)強(qiáng)烈抑制,因而認(rèn)為它是屬于活性中心含有絲氨酸殘基的酶類。羧肽酶Y可被一些金屬離子如Cu2+,Hg2+,F(xiàn)e2+,Mg2+等所抑制。因此在酶的分離制備過(guò)程中要防止與金屬離子接觸。羧肽酶Y在蛋白質(zhì)變性劑或某些溶劑存在下是相當(dāng)穩(wěn)定的,它與6mol/L尿素在25℃保溫1小時(shí)仍保留大約80%的活性。在10%甲醇存在下,25℃,pH5.5~8.0,8小時(shí)內(nèi)酶*穩(wěn)定。羧肽酶Y水溶液在25℃,pH5.5~8.0范圍內(nèi),它的活性在8小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。在37℃,pH6~8,2小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。在低于pH3,60℃以上保溫時(shí),酶迅速失活。酶在飽合硫酸銨溶液中,在-20℃可保存。1%的酶溶液(pH7.0)在-20℃冰凍保存,二年內(nèi)不失活。若稀釋到0.1mg/L則迅速失活。酶溶液的反復(fù)冰凍和融化或延長(zhǎng)室溫貯存時(shí)間,可引起酶本身的自溶。

  羧肽酶Y具有肽酶和酯酶活性,可用人工合成的苯甲氧羰二肽(CBZ-Phe-Leu)或N-乙酰酪氨酸乙酯(N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester,簡(jiǎn)稱ATEE)為底物,分別測(cè)定其肽酶活性或酯酶活性。一般多用紫外分光光度法測(cè)定酶活性。

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