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免疫染色實(shí)驗(yàn)方法和步驟編輯

1.樣品準(zhǔn)備(Sample preparation)

對(duì)于貼壁細(xì)胞：

Ø 可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培養(yǎng)細(xì)胞，然后到預(yù)定時(shí)間時(shí)進(jìn)行固定等后續(xù)操作。 Ø 也可以用潔凈的蓋玻片，70%乙醇中浸泡后，用無(wú)菌的鑷子放置到6孔板內(nèi)，然后用無(wú)菌的生理鹽水、PBS或培養(yǎng)液洗去殘留的乙

醇。這時(shí)就可以種入細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼在蓋玻片上生長(zhǎng)良好后，即可進(jìn)行固定等后續(xù)操作。

對(duì)于懸浮細(xì)胞：

Ø 把細(xì)胞先在固定液中固定，然后把細(xì)胞滴加在載玻片上，干燥后細(xì)胞會(huì)緊貼在載玻片上。然后就可以進(jìn)行后續(xù)操作。如果細(xì)胞的 粘附能力不佳，可以在載玻片上用PDL等物質(zhì)進(jìn)行處理，以增強(qiáng)載玻片的粘附能力。

對(duì)于冷凍切片：

Ø

切片放置在載玻片上后，可以直接進(jìn)行固定等后續(xù)操作。

對(duì)于石蠟切片：

Ø 脫蠟：切片在二甲苯中脫蠟5分鐘，再換用新鮮的二甲苯脫蠟，共用二甲苯脫蠟3次。無(wú)水乙醇5分鐘，兩次。90%乙醇5分鐘，兩

次，70%乙醇5分鐘，一次。蒸餾水5分鐘，兩次。

Ø 抗原修復(fù)：根據(jù)不同的抗原和抗體，可以選擇把切片放置在如下抗原修復(fù)液中，10mM檸檬酸鈉，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，

或10mM Tris, pH10.0，95℃加熱12分鐘，大約在30分鐘內(nèi)緩慢冷卻至室溫。

2.固定

Ø 可以使用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭?xì)胞或切片，例如碧云天生物試劑的免疫染色固定液。固定完畢后，可以用免疫染色洗滌液洗滌兩次，每 次5分鐘。

3.封閉(Blocking)

Ø

加入免疫染色封閉液，封閉60分鐘。如果背景較高，可以4℃封閉過(guò)夜。

Ø

從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。

Ø 在整個(gè)免疫染色過(guò)程中我們使用碧云天的側(cè)擺搖床，側(cè)向擺動(dòng)速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋樣品。如果樣品比較容 易脫落，也可以把所有的步驟放置在桌面上靜止進(jìn)行，即封閉、抗體孵育、洗滌等步驟均不需搖動(dòng)，但靜止操作時(shí)宜適當(dāng)延長(zhǎng)作

用時(shí)間或次數(shù)。

4.一抗孵育(Primary antibody incubation)

Ø

參考一抗的說(shuō)明書，按照適當(dāng)比例用免疫染色一抗稀釋液稀釋一抗。

Ø 用微型臺(tái)式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效

果不佳，可以4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜。

Ø 回收一抗。加入免疫染色洗滌液， 在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5分鐘。共洗滌3次。

如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

5.二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

Ø 參考二抗的說(shuō)明書，按照適當(dāng)比例用免疫熒光染色二抗稀釋液稀釋熒光標(biāo)記的二抗，或者用免疫染色(非熒光)二抗稀釋液稀釋辣 根過(guò)氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或堿性磷酸酯酶(AP)標(biāo)記的二抗。 Ø

用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。

Ø 回收二抗。加入免疫染色洗滌液， 在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5分鐘。共洗滌3次。

如果結(jié)果背景較高，可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

6.蛋白檢測(cè)(Detection of proteins)

Ø

對(duì)于免疫熒光染色，此時(shí)已經(jīng)可以直接到熒光顯微鏡下觀察。

Ø

對(duì)于非免疫熒光染色可以選用DAB等適當(dāng)?shù)娘@色底物，或AB檢測(cè)體系等進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

7.多重染色(Multiple staining)

Ø 如果進(jìn)行的是免疫熒光染色，通常都可以進(jìn)行多重染色。對(duì)于可以產(chǎn)生有色沉淀物的染色反應(yīng)，例如DAB染色，一般不適合再進(jìn)

行多重染色。

Ø 多重?zé)晒馊旧?/STRONG> 可以使用紅色熒光、綠色熒光和藍(lán)色熒光進(jìn)行三重?zé)晒馊旧?。例如用免疫熒光染色試劑?抗小鼠Cy3進(jìn)行紅色熒光染色，隨后可 以用免疫熒光染色試劑盒-抗兔Cy2進(jìn)行綠色熒光染色，在完成上述兩種染色后可以使用Hoechst染色試劑盒對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，

染色后為藍(lán)色熒光。

Ø 用HE染色進(jìn)行復(fù)染：

免疫熒光染色后可以用蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒進(jìn)行HE染色。

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