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COIP實驗代測

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白間相互作用的經(jīng)典方法，屬于免疫沉淀技術的一類，常被用于鑒定特定蛋白復合物的中未知蛋白組分。

服務說明

1. 細胞培養(yǎng)（貼壁細胞：100mm細胞培養(yǎng)皿中單層細胞長滿80％-90％或者細胞培養(yǎng)瓶中細胞達到2-5×10⁷個，懸浮細胞：離心收集細胞，細胞達到2-5×10⁷個）；
2. 加1ml（800uL）冰冷的 IP細胞裂解液到細胞培養(yǎng)皿中【IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影響實驗結果則應加入磷酸酶抑制劑（1:100），注意抑制劑要現(xiàn)加現(xiàn)用】4℃裂解細胞10min，再用移液器反復吹打貼壁細胞，然后將細胞懸浮液轉移到15ml離心管中；
3. 用1ml(400uL)冰冷的IP細胞裂解液【IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影響實驗結果則應加入磷酸酶抑制劑（1:100），注意抑制劑要現(xiàn)加現(xiàn)用】洗滌細胞培養(yǎng)皿，將殘留裂解細胞轉入15ml離心管中；
4. 10000g、4℃離心細胞裂解懸浮液10min，將上清轉入新的15ml離心管中，冰上操作，然后測定蛋白濃度（取少量細胞裂解液變性后用于WB檢測目的蛋白）；

選做：A.向細胞裂解液上清中加入1.0μg IgG（與IP及COIP實驗一抗種屬來源相同的普通IgG）和20μL A/G-珠子（使用前充分混勻），4℃搖轉孵育30min；

1.       ℃離心細胞裂解液5min，將上清轉入一個新的15ml離心管中，冰上操作，然后測定蛋白濃度（取少量細胞裂解液上清變性后用于WB檢測目的蛋白）；
2.  

5.  取以上細胞裂解液上清1ml（或者100-500μg細胞總蛋白）到1.5ml離心管中，加入1-10μL（0.2-2μg）一抗（同時加相同量的與一抗種屬來源相同的普通IgG作為陰性對照），然后4℃孵育1h；（一般加入1.0μg一抗，具體一抗加入量根據(jù)IP級抗體使用說明書進行稀釋）

6.  再加入20μL A/G-珠子（使用前充分混勻），用手指輕輕彈勻，4℃搖轉孵育過夜；

7.  4℃ 1000g離心5min，小心吸去上清，注意不要吸到底部的珠子，收集免疫沉淀復合物；

8.  將免疫沉淀復合物用1ml冰冷的IP裂解液（不用加各種抑制劑）洗滌4次，每次4℃ 1000g離心5min，每次洗滌小心棄去上清；

9.  zui后一次洗滌之后，小心棄去上清后，加入40μL 1×SDS含巰基乙醇的上樣緩沖液，沸水煮10min（除去Agrose-proteinA/G同時將一抗變成重鏈分子55KD和輕鏈分子25KD）后4℃1000g離心5min取上清；

10. 取20μL上清樣品用于WB檢測（選擇不同種屬的抗體分別進行免疫沉淀實驗和WB實驗，這樣再選擇一個種屬交叉反應比較弱或者無種屬交叉反應的二抗進行WB實驗，可以大大減弱抗體分子的重鏈和輕鏈分子的WB信號。）

實驗材料：1.Agrose-proteinA/G：Santa  貨號：SC-2003

2.IP細胞裂解液配方：

Tris-HCl(PH7.4,50mM)         6.055g

NaCl（150mM）              8.766g

0.25％脫氧膽酸               2.5g

1％ NP40                    10ml

EDTA(1mM)                  0.29225g

加純水定容至1L。

COIP實驗代測

注意事項

1. 免疫共沉淀是建立在蛋白復合物成員間彼此緊密結合的基礎上，意味著松散結合的蛋白組分很可能檢測不到；

2. 由于蛋白質形成復合物以后，某些表位就會被掩蓋，因此可能導致使用某一種pull-down抗體，無論怎么增加抗體濃度，也極少能將不到一半的目標蛋白復合物沉淀出來，如有必要使用多種不同抗體分別進行CoIP；

3. 由于檢測的是天然狀態(tài)，因此在不同的時間和不同的處理下，CoIP拉下來的蛋白復合物都可能是不同的，當然隨著實驗次數(shù)的增加，得到的蛋白復合物成員也會越來越龐大；

4. 如果使用Western Blot的方法檢測的蛋白復合物中的目標蛋白，則需要在試驗前進行預測，具有一定的冒險性；當然如果將蛋白復合物直接進行質譜分析就不存在上述問題，但需要得到較高純度和濃度的蛋白復合物樣品也非易事，并且成本較高；

5. CoIP鑒定得到的蛋白間相互作用可能是直接作用也可能是間接作用，進一步區(qū)分還需要進行GST-Pull down等實驗檢測；

6. 為了保證CoIP實驗的可靠性和嚴謹性，需要使用復合物的不同成員分別獨立進行CoIP實驗，并且結果應該能夠彼此驗證，因為原則上使用復合物的任一成員進行CoIP都會得到其他所有成員