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更新時(shí)間：2015-03-12 10:16:33瀏覽次數(shù)：101次
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小鼠內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)ELISA試劑盒操作寶典：
1. 抗原固定（包埋）：將對(duì)應(yīng)疫苗用0.05M的碳酸鈉（Na2CO3）溶液稀釋至2 微克/毫升， 在96孔ELISA薄板上每孔加100μL， 于37度2小時(shí)或4度冰箱過(guò)夜。第二天
2. 封閉（BLOCKING）：用PBSt沖洗薄板三次，每次必須把孔中液體拍掉. 再在每孔加1%脫指奶粉或BSA或0.1%吐溫（用PBSt稀釋）100μL，37度下放置30分鐘.
3. 用PBSt沖洗薄板3次，拍干孔中液體。
4. 滴度測(cè)試，每個(gè)樣本用8孔測(cè)試。
（1）如樣本為血清，則每孔加上100μL含5μg/mL抑制疫苗（用0.1%BSA的PBSt液稀釋），抑制疫苗為偶聯(lián)物和要檢測(cè)抗體的疫苗的偶聯(lián)物一樣的另一種疫苗。
（2）如樣本為已純化的抗體，則不用加抑制疫苗。
5. （1）血清樣本用含5μg/mL抑制疫苗溶液（用0.1%BSA的PBSt液稀釋）稀釋400倍.在*孔加100μL（總量為200μL/孔），混勻后移液100μL到第二孔，同樣混勻后從第二孔移液100μL到第三孔?????如此直至第7孔，留第八孔為空白對(duì)照。這樣從1-7孔的zui終樣本稀釋度分別為：1：800，1：1600，1：3200， 1：6400， 1： 12800， 1： 25600， 1： 51200。（2）抗體樣本則稀釋1000倍，混勻后移液50μL到第二孔.....至第七孔，留第八孔為空白對(duì)照。
6. 稀釋完后在37度反應(yīng)60分鐘.
7. 吸掉每孔中的液體，用PBSt分別清洗4次，每次拍干孔內(nèi)液體.
8. 上二抗：將抗兔IgG HRP用PBSt稀釋，稀釋倍數(shù)（1：5000-1：20000不等）由其濃度決定，每孔加100μL，37度反應(yīng)30分鐘后重復(fù)清洗步奏4次。
9. 拍干后每孔加入100μL的過(guò)氧化物酶（HRP）底物TMB生色. 37度大概15-30分鐘每孔加100μL2M硫酸終止反應(yīng)，然后在酶聯(lián)測(cè)試儀于波長(zhǎng)450納米讀數(shù).
10. 結(jié)果判斷、記錄：計(jì)算OD為50%時(shí)，血清（或抗體）的zui大稀釋度，以zui大稀釋度為樣品的滴度，記錄滴度，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告相關(guān)人員。
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